工程化改造Paraphoma chrysanthemicola角质解酶的酵母表面展示以实现聚酯塑料的生物降解

《Journal of Environmental Management》：Engineering yeast surface display of cutinase from Paraphoma chrysanthemicola for polyester plastic biodegradation

　　

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  漆酶PcCUT7被展示于Pichia pastoris表面。
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  表面展示的PcCUT7表现出增强的操作稳定性。
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  表面展示的PcCUT7在60小时内降解了75.2%的PBS薄膜。
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  开发了一种可重复使用的全细胞生物催化剂用于聚酯生物降解。

引言

自1909年酚醛树脂合成以来，塑料已成为现代社会中不可或缺的材料（Chen et al., 2020）。然而，赋予其耐用性的化学稳定性也导致了其在环境中的广泛积累。持续存在的塑料废物已成为一项全球性生态挑战，对人类健康、环境可持续性和经济发展构成了重大威胁（Schmaltz et al., 2020; Landrigan et al., 2023; Rahmat et al., 2025）。尽管传统的废物管理策略，包括机械回收和化学回收，有助于减少塑料的积累，但其效果仍受到聚合物多样性、污染和经济因素的制约。因此，需要可持续的方法来实现塑料的高效降解和资源回收（Wang et al., 2024）。为应对这些挑战，生物可降解塑料作为传统石油基塑料的有前景的替代品而出现。生物可降解塑料旨在通过微生物或酶解进行降解，生成对环境无害的产品，如二氧化碳、水和生物质，从而减少其长期环境持久性（Samir et al., 2022）。其中，脂肪族聚酯，如聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚丁二酸对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）和聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（P34HB），因其可水解的酯键和优良的物理化学性质而受到特别关注（Asri et al., 2024）。然而，尽管在理论上具有可生物降解性，但许多生物可降解塑料在自然环境条件下仍然降解缓慢（Chamas et al., 2020），凸显了需要更高效的生物降解策略。近年来，微生物和酶解方法已成为在温和条件下加速聚酯降解的有前景的策略，为生物可降解聚酯废物的可持续管理提供了新的机遇（Mishra et al., 2024）。

PBS由琥珀酸和1,4-丁二醇合成，已成为传统塑料的一种可持续替代品（Aliotta et al., 2022）。尽管PBS在理论上具有可生物降解性，但其在自然条件下的降解速率仍然相对有限，导致其在环境中积累（Lang et al., 2025）。真菌在PBS降解方面具有独特优势，因为它们可以分泌多种细胞外水解酶。在我们先前的工作中，一株植物病原真菌Paraphoma chrysanthemicola被鉴定为一种高效的PBS降解菌。该真菌分泌的漆酶（称为P. chrysanthemicola漆酶7，PcCUT7；PCC）分子量约为20 kDa，表现出PBS降解活性。在60小时内，超过50%的PBS薄膜被降解，降解产物主要由琥珀酸和丁二醇衍生物组成（Lin et al., 2025）。尽管PcCUT7具有良好的催化效率，但其实际应用仍受到生产成本、操作稳定性和催化剂回收方面的挑战的制约。

尽管游离酶具有催化效率，但它们通常存在稳定性有限、对环境波动敏感和重复使用性差的问题，这限制了其在大规模应用中的经济可行性（Yang et al., 2020）。固定化是增强酶稳定性和实现其重复使用的一种有效策略。在固定化方法中，酵母表面展示技术通过基因方式将酶锚定在微生物细胞壁上，具有独特优势。该策略无需纯化步骤，增加了局部酶密度，改善了酶-底物相互作用，并增强了操作的鲁棒性（Juturu and Wu, 2018）。在Pichia pastoris中，糖基磷脂酰肌醇锚定细胞壁蛋白（GPI-CWPs）已被广泛用作锚定模块。在一项先前的研究中，经GPI修饰的细胞壁蛋白（GCW61）在酵母表面展示系统中工作有效，并支持了展示酶的较高催化活性（Zhang et al., 2013）。

在本研究中，利用GCW61作为锚定模块，在P. pastoris GS115表面建立了一个用于PcCUT7的酵母表面展示系统。本研究旨在评估表面展示是否可以改善PcCUT7的催化性能和稳定性。将密码子优化的PcCUT7基因与GCW61进行基因融合，随后在Pichia pastoris GS115中异源表达重组融合蛋白。系统地评估了表面展示PcCUT7的酶学特性、稳定性谱和聚酯降解能力，以开发用于脂肪族聚酯生物降解的可重复使用的全细胞生物催化剂。因此，本研究为增强聚酯塑料（如PBS）的生物降解提供了有前景的策略，从而推动了可持续聚酯塑料管理的发展。

部分摘录

化学品和培养基

本研究中用作底物的生物可降解聚酯包括PBS（新疆蓝岭润和，TH-803S，Mw = 9.8 × 10⁴）、PLA（NatureWorks，2003D，含4.3 mol% D-乳酸单元，Mw = 12.9 × 10⁴）、PCL（Perstorp 6300，Mw = 3.3 × 10⁴）、PBAT（新疆蓝岭润和 TH801T，Mw = 9.3 × 10⁴）和P34HB（天津绿康生物，含24 mol% 4HB，Mw = 19.5 × 10⁴）。聚酯薄膜采用热压法制备，厚度均匀为0.3 mm，方法如先前的研究所述（Shi et al., 2020）。

构建P. pastoris表面展示系统

用SacI线性化的pPIC9K-PcCUT7-GCW61转化P. pastoris GS115感受态细胞，通过菌落PCR验证阳性转化子（图2A）。菌落PCR分析显示，所有18株选定的转化子中均检测到预期的扩增产物，表明PcCUT7-GCW61表达盒成功整合到基因组中。然而，PCR确认仅验证基因整合，并不一定反映蛋白表达或功能性表面展示。

结论

成功地在P. pastoris GS115中构建了利用GCW61作为锚定模块的PcCUT7酵母表面展示系统。表面展示的PcCUT7保留了其底物特异性。与游离酶相比，表面展示的PcCUT7表现出增强的热稳定性、改善的pH耐受性，以及对抑制性金属离子、有机溶剂和表面活性剂的更强抗性。此外，表面展示的PcCUT7表现出改善的储存稳定性和操作可重复使用性。

CRediT作者贡献声明

李马：撰写—原稿，调查研究，数据整理。孙可欣：调查研究，形式化分析。程润：调查研究。王占勇：撰写—审阅与编辑，监督，资源，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争经济利益或个人关系。

致谢

本研究由中国国家自然科学基金委员会（拨款编号：32270117）、辽宁省国际工业技术研发项目（拨款编号：2025JH2/101900001）以及沈阳农业大学人才计划（拨款编号：2021Y001）资助。

李马 | 孙可欣 | 程润 | 王占勇