高通量LC-MS/MS法同时定量人血浆CPI、PDA、NMN和m1A以评估转运体介导的药物-药物相互作用及健康志愿者生物标志物基线

《Journal of Chromatography B》：An LC-MS/MS assay for quantification of plasma biomarkers to assess transporter-mediated drug-drug interactions and biomarker baselines in healthy volunteers

　　

用于血浆中CPI、PDA、NMN和m¹A定量的高通量LC-MS/MS（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，液相色谱-串联质谱）测定法。单一自动化蛋白沉淀结合HILIC（hydrophilic interaction liquid chromatography，亲水相互作用色谱）-MS/MS和RPLC（reversed-phase liquid chromatography，反相液相色谱）-MS/MS。针对峰形、异构体分离和高通量测定稳定性进行优化。验证用于内源性血浆转运体生物标志物的替代基质（surrogate matrix）方法。在健康志愿者中评估生物标志物基线及其按BMI（body mass index，体质指数）、年龄和性别的变异性。

研究背景与问题。膜转运体（membrane transporters，介导药物跨膜转运的蛋白）在药物吸收、分布和消除中的作用已明确。药物-药物相互作用（drug-drug interactions, DDI）、遗传变异或疾病状态可改变转运体功能，影响药代和药效，并解释反应或毒性的个体差异。因此，预测疾病人群药代和评估早期临床DDI风险需理解转运体功能。监管机构认可多种内源性生物标志物（endogenous biomarkers，体内天然产生、可反映转运体功能的分子）用于评估转运体功能，ICH M12（International Council for Harmonisation guideline M12，国际人用药品注册技术协调会M12指南）强调可靠分析验证。LC-MS/MS适合小内源生物标志物，但内源化合物无空白生物基质，定量和验证复杂，需标准加入、背景扣除、替代分析物或替代基质（surrogate matrix，用于替代空白基质的校准基质）。研究人员选择ICH M12提及的CPI、PDA、NMN和m¹A，并考虑CPIII作为CPI结构异构体干扰。这些标志物与肝/肾OAT（organic anion transporters，有机阴离子转运体）、OCT（organic cation transporters，有机阳离子转运体）和MATE（multidrug/toxin extrusion，多药/毒素外排转运体）相关：CPI和CPIII为肝OATP1B（organic anion transporting polypeptide 1B，有机阴离子转运多肽1B）活性标志物，PDA为肾OAT1/3标志物，NMN和m¹A为肾OCT2、MATE1和MATE2-K标志物，血浆浓度在相应转运体抑制后因细胞摄取减少而升高。此前Kadar等的方法在pH 9需高盐和长平衡，不适合ESI（electrospray ionization，电喷雾电离）和高通量，因此需要开发更稳定、易自动化的方法，并建立健康志愿者基线及BMI、年龄、性别影响。

研究人员开发并验证了包含两套LC-MS/MS方法的高通量测定，HILIC-MS/MS测PDA、NMN、m¹A，RPLC-MS/MS测CPI和CPIII，采用单步自动蛋白沉淀。优化了色谱条件、样品前处理和替代基质。适合目的验证表明准确度和精密度符合标准。应用于64名健康志愿者血浆，建立基线和按BMI、年龄、性别的变异性。结论是该方法可用于未来DDI研究和疾病人群转运体功能研究，并提示CPI和PDA在跨人群比较时应至少控制性别和性别-年龄交互作用。

关键技术方法。采用Shimadzu Nexera-X2 UHPLC与SCIEX Triple Quad 7500质谱仪，Optiflow Pro离子源正离子模式MRM（multiple reaction monitoring，多反应监测）。HILIC采用Acquity Premier BEH Amide柱，RPLC采用Acquity Premier BEH C18柱。20 μL血浆经ACN（acetonitrile，乙腈）含0.1% FA（formic acid，甲酸）和IS（internal standard，内标）单步自动蛋白沉淀，上清分至两套LC-MS/MS。平行性实验比较人工血浆和3×charcoal-stripped人K₂EDTA血浆与native人K₂EDTA血浆，并用标准加入法评估。按ICH M10进行适合目的验证。临床样本来自64名健康志愿者，通过网站广告招募，伦理批准H-17029039，中位年龄34岁（18–74），中位BMI 23.1 kg/m²（17.6–31.6），55%为女性。

研究结果。3.1 LC-MS/MS优化：通过比较初始HILIC条件与二元泵系统，发现不进行高盐长时间柱平衡时CPI和CPIII显著峰拖尾，因此改为HILIC测PDA、NMN、m¹A，RPLC测CPI、CPIII。结论是双色谱法避免高盐和长平衡，适合高通量。3.1.1 HILIC-MS/MS优化（PDA、NMN、m¹A）：通过比较酸/碱流动相、不同盐浓度和溶剂组成，发现pH 3下PDA和m¹A峰拖尾或肩峰，天然血浆中干扰或峰分裂，故选pH 9。1 mM ammonium acetate时PDA保留降低、峰变宽，NMN保留增加和峰分裂，m¹A仅在10 mM可接受。10 mM ammonium acetate在A相沉淀，改用90% ACN含5%水5% MeOH后保持溶解并维持峰形和信噪比（signal-to-noise ratio, S/N）。结论是最终HILIC条件可实现保留、峰形和稳定性。3.1.2 RPLC-MS/MS优化（CPI、CPIII）：通过考察柱温30、40、60°C和梯度陡度，发现BEH C18柱60°C、b=0.032时CPI和CPIII基线分离，分离度3.35。因CPI血浆浓度约0.6±0.1 ng/mL，进一步优化离子源参数。结论是RPLC-MS/MS可准确分离和定量异构体。3.2 蛋白沉淀优化：通过比较ACN、MeOH、ACN:MeOH加/不加0.1% FA，评估响应、S/N、校准曲线精密度和沉淀/上清干重，发现ACN无FA时检测不到CPI和CPIII，可能共沉淀；ACN含0.1% FA对CPI和CPIII S/N和精密度最佳，清洁效率92.5±0.6%。结论是选用ACN含0.1% FA。3.3 平行性评价：通过比较人工血浆和3×charcoal-stripped血浆与native血浆校准曲线斜率，并用标准加入法计算负x截距，发现人工血浆对CPI和PDA斜率显著不同；3×charcoal-stripped血浆与native血浆可比，MF（matrix factor，基质因子）CPI 1.04、PDA 0.99；NMN各基质可比MF 0.96和1.01；m¹A两种替代基质均显著不同MF 0.91和0.95。百分比差异（percentage difference, PD）均<20%，3×charcoal-stripped对CPI、PDA、NMN为0.90–3.60%，m¹A为17.6%。结论是3×charcoal-stripped人K₂EDTA血浆为合适替代基质。3.4 适合目的验证：通过三批三天、八校准点、定量下限（lower limit of quantification, LLOQ）和低中高QC（quality control，质量控制）六重复及空白，评估校准曲线、准确度、精密度、残留、交叉-talk和稳定性。1/x加权最合适，R²>0.98，准确度和精密度符合标准；无残留；PDA交叉-talk为LLOQ响应11.5%，低于20%可接受限；运行内稳定（RPLC 14.4 h，HILIC 19.2 h）无显著差异；HILIC再进样24 h因溶剂蒸发不可行，RPLC 72 h稳定。结论是适合目的验证达标，但生产应用前应进行全验证。3.5 临床样品分析应用：通过分析64名健康志愿者血浆（三批），发现PDA 58、NMN 61、m¹A 44个测量值；PDA低于LLOQ、NMN高于定量上限（upper limit of quantification, ULOQ）导致测量数减少，m¹A有20个因技术分析问题排除。基线几何均值：m¹A 28.9 ng/mL，PDA 5.5 ng/mL，CPI 0.52 ng/mL，NMN 14.7 ng/mL。CPI、PDA、m¹A日间效应低，单血样可研究基线；NMN日间效应显著，限制其基线应用。NMN和m¹A肾清除变化对OCT2/MATEs活性较AUC（area under the curve，药时曲线下面积）敏感，限制相对血浆基线的偏移（offset-from-plasma-baseline）应用。BMI、年龄、性别分析显示全模型R²分别为CPI 0.16、PDA 0.31、NMN 0.07、m¹A 0.21。CPI多数方差由性别解释，加BMI后改善；简化模型男性CPI比女性高26.9%。PDA由性别、年龄及交互解释，女性PDA随年龄每年增加3%，男性随年龄变化小。m¹A男性高19%但简化模型不显著。NMN无变量显著，可能被日间效应掩盖。结论是评估这些生物标志物时需控制影响变量，CPI考虑性别，m¹A可能也需，PDA考虑性别-年龄交互，CPI也可能考虑BMI。限制是BMI和年龄范围有限，样本量44–64，属探索性。

讨论部分总结。讨论强调方法解决选择性、异构体分离、灵敏度、峰形、稳定性和盐析出等色谱挑战；单步蛋白沉淀可同时支持两套LC-MS/MS；3×charcoal-stripped K₂EDTA血浆适合替代基质；适合目的验证满足接受标准。健康志愿者基线和其他研究相似，但NMN日间效应、m¹A作为OCT2/MATEs标志物需进一步研究。性别和年龄影响提示跨人群比较需控制变量。研究局限是BMI和年龄范围有限、样本量不大，外推需谨慎。

研究结论翻译。研究人员成功开发了一种准确的LC-MS/MS测定法，包含两种方法，用于定量人血浆中的PDA、NMN、m¹A和CPI，并已应用于临床样品的高通量分析。研究解决了与选择性、异构体分离、灵敏度、峰形、分析稳定性和盐析出相关的多个色谱挑战，同时单步蛋白沉淀实现分析物提取并将上清液分至两种LC-MS/MS方法。平行性实验证实3×charcoal-stripped K₂EDTA人血浆是合适的替代基质，适合目的的验证表明准确度和精密度在可接受标准内。通过定量健康志愿者血浆中的PDA、NMN、m¹A和CPI，建立了按BMI、年龄和性别分层的基线和变异性。结果表明，在评估不同人群血浆浓度差异时，CPI和PDA至少应分别控制性别和性别-年龄交互作用。