健康马皮肤单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集解析22个细胞群并建立正常马皮肤转录组参考图谱

《Scientific Data》：A single-cell RNA-seq dataset characterizing cellular diversity in healthy equine skin

　　

皮肤是马的主要屏障组织，并常受免疫介导性皮肤病影响，其中最显著的是昆虫叮咬过敏（insect bite hypersensitivity, IBH）。然而，正常马皮肤的细胞组成和转录景观从未在单细胞分辨率下得到表征。在此，研究人员展示了一个健康马皮肤的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集，包含来自两匹马的85,574个高质量转录组，每匹马采集一个皮肤活检，并分成两部分，通过手动或自动组织解离进行独立处理。该数据集解析出22个转录上不同的细胞群体，涵盖反映离散表皮分化状态的角质形成细胞（keratinocyte, KC）亚群、附属器上皮谱系、基质和血管区室以及驻留免疫细胞类型。细胞类型身份由标记基因表达、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析和功能模块评分支持。该数据集构成了正常马皮肤的首个单细胞转录组参考，使研究人员能够开展马皮肤病学、伤口愈合、免疫反应和比较皮肤生物学研究。

论文解读：健康马皮肤单细胞RNA测序数据集解析细胞多样性并构建转录参考

研究背景与问题
皮肤是马体最大的器官，承担屏障、体温调节、触觉和免疫等功能。表皮为角质化复层鳞状上皮，主要由角质形成细胞（keratinocyte, KC）组成，并含黑素细胞、Langerhans细胞和Merkel细胞；真皮以成纤维细胞为主，合成细胞外基质（extracellular matrix, ECM），并含毛囊、腺体和感觉神经受体，健康马真皮血管周围还有肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞。马受多种皮肤病影响，其中昆虫叮咬过敏（insect bite hypersensitivity, IBH）是全球最常见的过敏性皮肤病之一，不同国家发病率为3%至60%。IBH由对Culicoides属蠓唾液过敏原的I型和IV型超敏反应引起，表现为严重瘙痒性皮炎。既往对IBH皮损的研究发现KC屏障功能障碍、细胞因子表达升高及免疫细胞蓄积，主要涉及肥大细胞、嗜酸性粒细胞和Th₂细胞。但这些认识多来自组织学、免疫学测定或bulk转录组方法，治疗选择有限。要识别疾病相关细胞反应，需要正常马皮肤作为参考状态；然而，正常马皮肤的细胞组成尚未在单细胞分辨率下被表征。因此，研究人员旨在生成并验证正常马皮肤单细胞转录组数据集，作为未来马皮肤生物学和疾病研究的参考资源。具体目标包括：从临床健康马皮肤生成高质量单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据；使用已建立的质控和注释流程评估数据集质量与细胞代表性；提供原始和处理数据、元数据及分析流程供研究界重复使用。

研究开展与总体结论及意义
研究人员从两匹临床健康马采集鬃部皮肤活检，在Culicoides活动最少时期进行分析，使用Singleron Biotechnology平台。获得的数据集包含85,574个高质量转录组，解析22个不同细胞群体，并附有完整处理流程、质控指标和注释标准。该资源为正常马皮肤提供单细胞参考数据集，支持未来皮肤病、免疫功能障碍和跨物种生物学研究。作为正常马皮肤的首个单细胞转录组参考，该数据集使研究人员能够研究马皮肤病、伤口愈合、免疫反应和比较皮肤生物学。

关键技术方法
样本队列来源为两匹临床健康、私人拥有的母马，饲养于瑞典Uppland同一马厩，2024年10月非季节采集：24岁荷兰温血马（donor C_1）和25岁威尔士矮马（donor C_2）。每匹马从鬃基部采集一个6-mm皮肤活检，每份活检分为a和b两部分，分别进行手动或自动组织解离，形成C_1a、C_1b、C_2a和C_2b四个样本，独立进行scRNA-seq。主要技术包括：Singleron平台单细胞分离与文库构建；CeleSCOPE和STARsolo进行转录组预处理，使用EquCab3.0参考基因组；Seurat进行质控，采用基于中位绝对偏差（median absolute deviation, MAD）的自适应阈值；DoubletFinder检测双细胞；Harmony校正批次；UMAP降维和Louvain聚类；Wilcoxon秩和检验鉴定标记基因；KEGG通路富集；AUCell进行功能模块评分；数据存入NCBI SRA和Figshare。

研究结果
质量控制过滤获得高置信度单细胞数据集。四个样本初始捕获100,434个细胞，基于nCount_RNA、nFeature_RNA和线粒体基因比例的自适应质控保留93,002个高质量细胞，总保留率92.6%。各样本保留率为C_1a 87.89%、C_1b 92.66%、C_2a 94.08%、C_2b 93.12%。质控后nCount_RNA、nFeature_RNA和percent.mt分布高度一致，提示数据质量均一且批次效应小。

双细胞去除进一步纯化细胞质量。计算双细胞检测识别7,428个推定双细胞，总体7.99%；各样本为C_1a 661个（6.44%）、C_1b 2,345个（7.94%）、C_2a 1,882个（8.01%）、C_2b 2,540个（8.55%）。双细胞nCount_RNA和nFeature_RNA升高，线粒体比例仍低，提示分类无偏。去除双细胞后保留85,574个高置信度单细胞用于下游分析。

单细胞RNA测序解析马皮肤细胞景观。pseudo-bulk主成分分析显示两个解离重复沿PC_2分离，C_1b和C_2b接近；Spearman相关分析显示所有样本间相关性高（ρ=0.928–0.963，p<0.0001），最高为C_1b与C_2b（ρ=0.963）。Harmony整合后，四个样本细胞在共享簇中广泛混合，所有22个簇均存在于四个样本中。无监督图聚类获得22个转录上不同的细胞群体。KC亚群涵盖基底层、基底祖细胞样、过渡态和棘层，以及增殖、活化、应激反应和活化/炎症棘层状态，占55.28%（范围49.33–64.61%）。增殖KC由TOP2A、PCNA、TYMS、RRM2、UBE2C等细胞周期标记定义；活化KC由KRT6A、KRT6B、KRT6C、KRT16和KRT17定义；应激反应KC由EGR1、DUSP1、ATF3、JUN、JUND、NR4A1、IER2、HSPA6、DNAJB1、GADD45A/B、NFKBIA等即刻早期反应基因定义。附属器群体包括顶泌汗腺、外泌汗腺、毛干KC、皮脂腺细胞及内、外根鞘KC，占22.17%（18.22–24.30%）。非上皮群体包括血管和色素细胞（内皮细胞和黑素细胞，14.15%；9.27–17.14%）、基质细胞（成纤维细胞和平滑肌细胞，5.27%；2.73–10.46%）和免疫细胞（T细胞、肥大细胞和巨噬细胞，3.11%；2.63–4.19%）。22个注释群体中9个在四样本间比例变化<2个百分点；4个与解离方法相关：内皮细胞、皮脂腺细胞和基底祖细胞样KC在自动解离中较高，增殖KC在手动解离中较高；活化KC呈混合模式；毛干KC与供体身份相关；其余7个显示样本特异性变异。由于样本量小（每供体n=2），这些模式应描述性解释，而非统计学确认效应。

细胞类型特异性通路富集揭示不同功能身份。KEGG富集验证了细胞类型注释。基底层KC富集于ECM-受体相互作用和黏着斑通路；活化KC富集于紧密连接和黏附连接信号；增殖KC显著富集DNA复制、细胞周期和p53信号（-log₁₀ adjusted p>5）；应激反应KC富集MAPK、TNF和IL-17信号及凋亡；毛干和外根鞘KC均富集氧化磷酸化；皮脂腺细胞富集脂肪酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成（-log₁₀ adjusted p>10）。免疫群体中，巨噬细胞富集NF-κB、NOD样受体、Toll样受体和趋化因子信号及抗原加工呈递；肥大细胞富集Fc epsilon RI信号、MAPK信号和花生四烯酸代谢；T细胞富集T细胞受体信号、Th₁/Th₂和Th₁₇分化及趋化因子信号。内皮细胞富集白细胞跨内皮迁移、补体和凝血级联。平滑肌细胞富集细胞骨架和血管平滑肌收缩通路及NF-κB和TNF信号；成纤维细胞富集ECM-受体相互作用、PI3K–Akt信号和黏着斑。

功能模块分析识别细胞类型特异性生物学程序。12个功能模块评分投影到UMAP。免疫监视模块所有簇低活性；氧化应激防御模块几乎所有细胞类型广泛激活；细胞信号和代谢模块广泛但峰值在毛干KC、活化KC、增殖KC和顶泌汗腺细胞。表皮结构完整性和屏障成熟模块集中于KC；脂质屏障生物合成模块选择性富集于皮脂腺细胞；干细胞维持模块基底层KC最高；上皮离子转运模块限于顶泌汗腺细胞；血管稳态和平滑肌收缩模块分别在内皮细胞和平滑肌细胞活跃；黑素生成模块限于黑素细胞；基质维持模块主要活跃于成纤维细胞。这些模块活性与已知细胞生物学一致，提供正交功能验证，结合高细胞回收率、低双细胞污染、稳健标记表达和通路富集，证明数据集技术质量和生物学有效性。

讨论与结论
该数据集作为正常马皮肤的首个单细胞转录组参考，提供细胞组成、标记基因、通路和功能模块信息，并公开原始与处理数据、元数据和流程，支持未来马皮肤病、免疫功能障碍、伤口愈合、免疫反应和比较皮肤生物学研究。研究结论翻译：该数据集构成正常马皮肤的首个单细胞转录组参考，使研究人员能够开展马皮肤病学、伤口愈合、免疫反应和比较皮肤生物学研究。