PRPF31.AAV基因治疗在患者来源RPE与视网膜类器官中恢复剪接稳态并挽救RP11表型

《Nature Communications》：Cell-autonomous restoration of splicing homeostasis and RP11 phenotype in patient-derived RPE and retinal organoids by PRPF31.AAV gene therapy

PRPF31基因发生突变可导致11型视网膜色素变性（retinitis pigmentosa type 11, RP11），这是一种由剪接体（spliceosome）即负责RNA加工的细胞内机器缺陷所引发的进行性致盲疾病。尽管基因替代（gene replacement）具有治疗前景，但其能否在不同疾病阶段有效挽救两类主要靶细胞仍不清楚。研究人员显示，病毒介导的PRPF31递送至患者来源的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞与三维视网膜类器官（retinal organoids, ROs）可恢复RNA剪接活性并逆转核心细胞病理。基因递送清除了毒性蛋白聚集体，恢复了RPE基本功能，包括结构极性、纤毛完整性与细胞废物清除，并增强了光感受器的光诱发活性。值得注意的是，即使在成熟细胞中也可获得稳健挽救，而基因治疗与激活自噬药物联用未带来额外获益。这些发现表明，仅恢复剪接稳态即可驱动功能恢复，支持PRPF31基因治疗在RP11中具有较宽临床窗口。

研究背景方面，视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是最常见的遗传性致盲疾病之一，患病率约1/3000–5000。除RPE65突变亚型已有Luxturna治疗外，绝大多数RP基因型无获批疗法。PRPF31等前体mRNA加工因子基因（pre-mRNA processing factor genes）是常染色体显性RP第二常见原因，其中PRPF31突变占常染色体显性RP的8.9%，导致RP11。多数PRPF31突变为无效等位基因，使总蛋白水平下降并损害剪接体组装，因此RP11主要被归因于单倍体不足（haploinsufficiency）。PRPFs为U4/U6.U5 tri-snRNP复合体的组成成分，该复合体是催化前体mRNA剪接的剪接体主要亚基。虽然PRPF广泛表达，却主要引起视网膜特异性疾病，因视网膜细胞高替代剪接率使其对剪接体破坏特别敏感。既往研究表明，突变PRPF31蛋白不整合入正常剪接体复合体，而是错误定位至细胞质并形成聚集体， trapping野生型PRPF31，降低核内浓度，损害tri-snRNP形成，扰乱前体mRNA剪接；RP11患者诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源RPE细胞和视网膜类器官（ROs）出现核斑（nuclear speckle）异常、吞噬障碍、纤毛发生缺陷、光感受器退化及未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）与废物清除失败。已有研究用AAV2/Anc80或AAV2-7m8在RPE或ROs中部分挽救表型，但缺乏同时对RP11根本致病机制及RPE与ROs双细胞系统同步挽救的证据。因此，研究人员开展本研究，以AAV介导PRPF31基因增强（gene augmentation）策略，在患者iPSC来源RP11-RPE与RP11-ROs中评估其对蛋白定位、核斑完整性、胞质聚集体、纤毛、吞噬、光诱发网络活动及转录组/蛋白质组的修复作用。论文发表于《Nature Communications》。

主要关键技术方法方面，研究人员使用患者来源iPSC分化的RPE细胞与视网膜类器官作为疾病模型，并以同基因CRISPR校正细胞系作参照；通过AAV-ShH10(Y445F)载体进行PRPF31体内外递送并做剂量优化；采用定量RT-PCR、western blotting、免疫荧光评估分子与细胞表型；用pHrodo标记光感受器外节（photoreceptor outer segments, POSs）进行活细胞吞噬成像；以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGC）放电栅格图与直方图分析光诱发视网膜环路活动；开展bulk RNA-seq与rMATS可变剪接分析；采用串联质量标签（tandem mass tag, TMT）质谱进行定量蛋白质组学；并在成熟RPE（培养>12周）中检验晚期疾病阶段疗效，以及联用雷帕霉素（rapamycin）考察自噬激活是否有叠加效应。

研究结果方面，优化AAV介导基因递送在iPSC来源RPE与视网膜类器官中部分显示，RPE单次1×10⁵ vg/cell可兼顾转导效率与低毒，ROs单次3×10⁶ vg/cell可在CD73⁺光感受器取得平衡转导并保活力。AAV介导PRPF31递送增加核内PRPF31水平并恢复视网膜细胞核对斑部分显示，RP11-RPE与ROs经PRPF31.AAV后，总PRPF31 mRNA与蛋白上升，PRPF31回核，SC35⁺核斑强度与体积恢复，RPE顶-底极性重建；ROs中光感受器核周剪接位点增多，磷酸化SF3B1（p-SF3B1）标记的活动剪接体丰度上升，说明剪接机器功能恢复。PRPF31.AAV处理阻止细胞毒聚集体累积并挽救PRPF31缺陷RPE和光感受器纤毛缺陷部分显示，RLBP1与HSPB1胞质聚集体在RPE和ROs光感受器层均显著减少，ARL13B标记的原纤毛长度与发生率在两类细胞中回升。PRPF31.AAV递送改善RPE细胞吞噬活动并增强PRPF31缺陷光感受器光诱发反应部分显示，RPE对POSs内化面积增至约59.3%，远高于对照；ROs中RGC对脉冲光的增加型反应比例与幅度在PRPF31.AAV组更高，提示光感受器网络与突触传递恢复。PRPF31增强挽救RP11视网膜模型转录组缺陷部分显示，RPE有251个差异基因、ROs有1128个差异基因；RPE上调淀粉样β清除与脂蛋白受体介导内吞相关基因，下调TNF/IL-17炎症信号；ROs上调突触功能与视觉系统发育基因，下调阿尔茨海默病与肌萎缩侧索硬化相关聚集体/RNA代谢病理转录本；rMATS显示跳跃外显子最常见，ROs另有较多可变3′剪接位点（alternative 3′ splice site, A3SS），差异剪接基因富集于纤毛组装、视觉感知、RNA分解代谢及光感受器内段。AAV介导PRPF31增强重塑RP11-RPE与光感受器蛋白质组并恢复代谢和视觉循环通路部分显示，RPE鉴定230个差异蛋白、ROs 46个；RPE上调网格蛋白介导内吞（clathrin-mediated endocytosis）、自噬/巨自噬、线粒体ATP合成、吞噬相关蛋白（CLTA、CLTB、CDC42、NPC2、CALM3、CHMP2B等），并与CRISPR校正RPE共享MT-ATP8、TXN2、SRSF4、SRSF9、RBM5等恢复趋势；ROs中RHO、RDH5、RRM2B、FDXR等视觉循环与线粒体蛋白被调控。PRPF31增强挽救晚期RP11-RPE病理部分显示，成熟RP11-RPE转导PRPF31.AAV后，胞质PRPF31减少，SC35⁺核斑恢复，RLBP1/HSPB1聚集体清除，纤毛长度与发生率回升，POSs吞噬由约9.4%提升至18.3%。联合自噬激活与PRPF31基因增强不增强细胞挽救部分显示，成熟RPE中雷帕霉素本身可减少聚集体并改善纤毛，但联用PRPF31.AAV未见超越单用AAV的叠加效益，说明PRPF31恢复已覆盖雷帕霉素所激活通路。

讨论与结论部分，研究人员指出PRPF31突变通过单倍体不足削弱剪接体功能，引发RPE与光感受器级联缺陷；AAV-PRPF31不仅提升PRPF31表达，还恢复核定位、SC35核斑、p-SF3B1活动剪接体灶，并借正反馈修正mRNA加工、纤毛与视觉感知相关转录本剪接。转录组与蛋白质组共同显示聚集体清除、内吞/自噬、线粒体与视觉循环通路回归稳态，对应RPE极性、纤毛、吞噬恢复及ROs光诱发活动增强。晚期成熟细胞仍可被挽救，但幅度低于早期细胞；自噬激活药无附加获益。结论可译为：本研究证明，AAV介导的PRPF31基因增强可在患者来源RPE与视网膜类器官中恢复剪接稳态、清除蛋白聚集体、修复纤毛与吞噬功能、增强光感受器环路反应，并在转录组与蛋白质组层面重塑健康态；即使成熟细胞也具可挽救性，且无需联用自噬激活即可生效，这支持PRPF31基因治疗在RP11中拥有较宽临床时间窗，并为剪接因子缺陷性视网膜病提供了细胞自主治疗依据。