通过重定向受体转运与溶酶体降解实现G蛋白偶联受体（GPCR）功能性拮抗的GPCR–TfR1靶向嵌合体（GTAC）平台

《Nature》：GPCR antagonism via rewiring of receptor trafficking and degradation

G蛋白偶联受体（GPCRs）是最重要但尚未被充分解决的治疗靶点类别之一。在此，研究人员报告了一种通过双特异性抗体介导的内吞和溶酶体降解实现功能性GPCR拮抗的策略。GPCR–TfR1靶向嵌合体（GTACs）可实现多种GPCR的有效且选择性下调，包括BILF1、RXFP1和CCR6——这些病毒、癌症和免疫靶点难以成药。GTACs导致受体信号传导（包括组成型信号传导）的完全抑制，其效力比传统抗体拮抗剂高1–2个数量级以上。利用蛋白质工程和多色活细胞成像，研究人员建立了情境依赖性降解剂设计并解释其细胞机制，对降解剂技术具有广泛相关性。GTAC平台将诱导内吞和重定向蛋白质转运确立为治疗性GPCR调节的模型。

该论文发表在《Nature》。研究背景是，G蛋白偶联受体（GPCR）是最大受体家族，超过800个成员，在生理和疾病中具有重要作用；约三分之一的美国FDA批准药物靶向GPCR，但治疗成功不成比例地集中在小亚类，尤其是生物胺受体，许多肽结合受体、脂质受体、孤儿受体和感觉受体仍未充分探索。当前GPCR抑制剂通过竞争配体或稳定非活性受体构象发挥作用，但高亲和力竞争性拮抗剂开发困难，且配体非依赖性组成型信号难以抑制。对肽和蛋白结合GPCR，自分泌或旁分泌信号以及配体高亲和力和局部高浓度会降低竞争性抑制效果；生物拮抗剂也常因功能结合口袋埋藏于受体内而难以工程化。内源性GPCR信号受内溶酶体转运动态调控，内化、回收和降解与配体结合、胞内磷酸化和β-arrestin招募紧密耦合。研究人员据此提出，诱导GPCR与内化受体邻近可合成性触发GPCR内吞和溶酶体递送，从而沉默受体信号。虽然小分子PROTACs和分子胶可招募胞内蛋白酶体，LYTAC、AbTAC、PROTAB、KineTAC、EndoTag、LIPTAC和TransTAC等抗体模态可利用细胞表面效应器进行溶酶体降解，但小分子策略用于GPCR疗效有限，系统探索诱导邻近调控GPCR仍缺乏。

研究人员开展了GTAC平台研究：构建双功能抗体，利用转铁蛋白受体1（TfR1）快速、组成型内化控制GPCR内吞、降解和信号。GTACs可高效耗竭并拮抗血管紧张素II 1型受体（AT1R）、松弛素家族肽受体1（RXFP1）、C–C趋化因子受体6（CCR6）及病毒编码的组成型活性GPCR BILF1；并进一步推广至apelin受体（APJ）、腺苷A2A受体（A2AR）和M3毒蕈碱乙酰胆碱受体（M3R）。研究表明，GTACs比传统拮抗剂效力高10–100倍以上，并改善疗效，使传统药理学难以或无法靶向的受体可被调控。论文结论是，诱导内吞和降解可作为模块化GPCR拮抗机制，扩展了针对传统占位性抑制难以处理受体的药理学工具。

关键技术方法不超过250字概括：研究人员采用蛋白质工程构建双特异性GTAC，将GPCR结合域与TfR1结合域融合至人IgG1 Fc，采用同二聚体融合或knobs into holes；使用TfR1 scFv H7、纳米抗体VHH-A，以及AT1R、APJ、A2AR、RXFP1、CCR6和抗FLAG M2等结合模块，建立FLAG GTAC通用系统。方法包括流式细胞术、Western blot、报告基因（NFAT-luciferase、β-arrestin Tango、GloSensor cAMP、NF-κB–GFP）、多色活细胞共聚焦成像与共定位、生物层干涉（BLI）、split-luciferase邻近实验、qPCR、Transwell趋化、F-actin聚合、电致变色光学记录（ECORE）、人iPSC衍生心肌细胞、原代人TH17细胞分化及IMQ诱导银屑病hCCR6转基因小鼠模型。样本来源包括：人iPSC来自Stanford Cardiovascular Institute Biobank；人外周血单核细胞来自Brigham and Women’s Hospital Crimson Core；OVCAR-8由Robert Rottapel实验室提供；PC9可诱导TfR1敲低细胞由Pasi J?nne实验室提供；hCCR6转基因C57BL/6N小鼠购自Biocytogen。

研究结果：
GTACs potently deplete and inhibit GPCRs：研究人员用带FLAG标签的AT1R、RXFP1、APJ和A2AR与TfR1–v5共表达，通过流式检测发现GTACs可耗竭40–90%细胞表面受体，IC₅₀为皮摩尔至个位数纳摩尔；AT1R GTAC还降低GFP荧光，提示总蛋白降解，D_max=65%，DC₅₀≈1 nM；耗竭1小时内出现并稳定至少24小时；非AT1R靶向GTAC不显著耗竭AT1R，说明靶点特异性。AT1R GTAC抑制ANGII诱导的NFAT-luciferase和β-arrestin招募，比Nb–Fc强10倍以上；RXFP1 GTAC以IC₅₀≈30 pM近完全拮抗RLN2信号，比Nb–Fc强200倍以上，并在高级别浆液性卵巢癌中下调MMP9、MMP23B、NOTCH1、NOTCH3和DVL1等靶基因。结论是GTACs是模块化、广泛适用的快速持久GPCR耗竭和降解方法，诱导降解可增强GPCR拮抗。

FLAG GTAC inhibits constitutive activity：研究人员利用抗FLAG M2片段抗体构建FLAG GTAC，不干扰内源配体结合；其纳米级结合并诱导AT1R内化和降解，抑制ANGII诱导的β-arrestin招募，而FLAG–Fab不扰动信号；共聚焦显示GTAC处理6小时后约60% GFP信号丢失。对BILF1，FLAG GTAC耗竭70–80%细胞表面BILF1，抑制NF-κB驱动GFP表达，IC₅₀≈0.8–1 nM，并恢复被BILF1下调的MHC-I。对缺乏高亲和高选择性抗体的M3R，FLAG GTAC诱导约70%降解，拮抗iperoxo诱导的β-arrestin招募（I_max=58%，IC₅₀≈2 nM）。结论是FLAG GTAC可作为通用工具，实现GPCR耗竭、拮抗和组成型活性阻断，且不依赖特定GPCR结合剂。

Context-dependent GTAC design：针对CCR6，研究人员开发第二代GTAC，采用非竞争性和较低TfR1亲和力结合变体。split-luciferase邻近实验和流式显示，降低TfR1亲和力增强CCR6依赖性GTAC–TfR1相互作用；TfR1LOW表现出最强CCR6依赖性细胞结合。在CCR6⁺ Jurkat细胞中，TfR1HIGH和TfR1LOW GTAC均诱导约85% CCR6耗竭和降解，TfR1LOW更持续24小时；TfR1HIGH部分共降解TfR1，低亲和力GTAC不影响TfR1水平。GTACs抑制约100% CCL20诱导的β-arrestin招募、F-actin聚合和Jurkat迁移，IC₅₀≈0.4–4 nM，TfR1LOW抑制更强；拮抗抗体仅抑制55–60% F-actin聚合和趋化。TfR1敲低减少靶降解，证实TfR1依赖性。结论是情境依赖性GTAC可选择性作用于CCR6⁺细胞并避免TfR1丢失，优于传统拮抗抗体。

GTAC rewires GPCR trafficking：研究人员在HeLa细胞中进行多色活细胞成像，稳定表达CCR6–GFP、BFP–TfR1及mCherry标记的RAB5、RAB7、RAB11或LAMP1。CCL20诱导受体内化但无明显CCR6–GFP信号丢失，而TfR1HIGH和TfR1LOW GTAC处理24小时后近完全丢失CCR6–GFP信号，说明GTAC而非天然激动剂促进受体降解。GTAC处理4小时增加CCR6与RAB7和RAB11共定位，提示增强进入降解和回收通路；TfR1LOW GTAC相较TfR1HIGH增加TfR1回收。AT1R也显示类似区别：GTAC诱导快速内化、信号丢失和胞内滞留，ANGII仅短暂内化后表面受体恢复。RXFP1膜表达低、主要位于核周，GTAC可重分配表面池但耗竭较低，且RXFP1缺乏激动剂诱导内化，GTAC仍可诱导内化。结论是GTAC改变GPCR转运机制不同于天然激动剂，促进加速内吞和持续耗竭，并可通过调节TfR1亲和力优化TfR1回收。

Determinants of GTAC activity：研究人员用小分子抑制剂、GPCR突变体和GTAC变体解析决定因素。蛋白酶体抑制剂MG132不影响AT1R或CCR6下调；bafilomycin A1或chloroquine破坏溶酶体功能则消除GTAC诱导降解，恢复总AT1R和CCR6水平，说明降解依赖溶酶体。cycloheximide阻断新蛋白合成增强AT1R降解，提示受体耗竭程度由内化、回收、溶酶体降解和蛋白合成共同决定。AT1R T282M和TSTS/A突变减少ANGII介导内化，但FLAG GTAC和AT1R GTAC仍高效降解所有变体，说明GTAC内化和降解独立于β-arrestin依赖性内化。CCR6 Fab轻链CDR1中H31参与pH依赖性结合，H31A突变消除pH敏感性并降低结合，H31A TfR1HIGH GTAC降解活性降低约3倍。几何、亲和力和价态测试显示，RXFP1 GTAC偏好2:1靶点:TfR1结合化学计量，AT1R偏好二价TfR1结合，CCR6偏好1:1；TfR1共耗竭取决于靶点背景和GTAC设计，AT1R二价TfR1增加耗竭但部分共耗竭，CCR6降低TfR1亲和力可避免TfR1丢失，相对受体丰度也影响TfR1共耗竭。结论是GTAC平台具有模块性和稳健性，但最佳设计因GPCR靶点而异。

ANGII inhibition in hiPSC cardiomyocytes：研究人员用人iPSC衍生心肌细胞和ECORE评估内源AT1R信号。ANGII刺激增加心肌细胞搏动率并缩短搏动间隔；AT1R GTAC预处理在7 nM抑制约两倍，在70 nM完全消除该反应，并抑制85–95%的机械搏动逐搏变异。AT1R Nb–Fc对照可部分抑制，但AT1R GTAC抑制更完全。结论是GTAC介导的受体耗竭在人iPSC衍生心脏模型中比竞争性抑制更完全地抑制AT1R通路。

CCR6 antagonism in TH17 cells and in vivo：研究人员将TfR1LOW CCR6 GTAC与临床阶段小分子PF-07054894比较，发现GTAC对趋化抑制更强；CCR6 Fab对CCR6选择性高于CCR7和CXCR2。原代人TH17细胞中，TfR1LOW GTAC和H7 GTAC在2小时诱导高达95% CCR6内化，亚纳摩尔效力；2小时GTAC处理抑制约90% CCL20诱导的TH17趋化，而亲本CCR6拮抗剂I_max=55%。TfR1LOW GTAC优先结合CCR6⁺ TH17细胞而非CD3⁺ pan-T细胞。体内IMQ诱导银屑病hCCR6转基因C57BL/6N小鼠模型中，TfR1HIGH GTAC或CCR6 Fab–Fc腹腔注射10 mg kg^?1连续6天，不引起体重变化；GTAC显著降低临床评分和表皮增生，抑制皮肤Il17a、Il1b和Cxcl2表达，耗竭中性粒细胞和炎性单核细胞上hCCR6，但不降低hCCR6 mRNA。mTfR1免疫荧光显示脾和脑TfR1不降低，肝TfR1低且不变；非竞争TfR1HIGH或TfR1LOW纳米抗体不损害TfR1介导的铁摄取，以FerroOrange检测胞内不稳定Fe²⁺证实。体内抗体循环时间达3天（TfR1HIGH GTAC）或10天（H7 GTAC、TfR1LOW GTAC和CCR6 Fab–Fc）。研究也指出该人源化模型中mCCL20对hCCR6活性降低、GTAC与mTfR1结合降低，未来需交叉反应或小鼠替代GTAC进一步评估治疗潜力。

讨论部分总结：细胞外靶向蛋白降解已成为调节分泌和膜蛋白的新机制。该研究系统研究细胞外GPCR降解剂工程，跨七个靶点，GTACs在工程细胞系统、癌症模型、iPSC衍生心肌细胞和人原代细胞中一致实现靶降解并强效抑制GPCR信号，效力比传统拮抗剂高1–2个数量级，确立诱导内吞和溶酶体降解作为通用、强效、持久GPCR拮抗机制。对RXFP1，GTAC抑制cAMP信号比亚纳摩尔Nb拮抗剂强200倍以上，获得皮摩尔效力生物拮抗剂，显示靶向降解可克服高配体敏感性。对CCR6，GTAC在原代免疫细胞和体内诱导完全降解与功能抑制，克服趋化因子高局部浓度和高亲和多表位相互作用。对BILF1，GTAC抑制组成型信号并逆转NF-κB和MHC-I下游效应，表明靶向降解可抑制组成型受体信号。研究还提出降解剂设计原则：降低效应器亲和力可产生情境依赖性降解剂；pH敏感结合可能通过促进内体释放增强降解，但非必需；非竞争TfR1结合剂和亲和力工程推进TfR1靶向生物药工程，同时长期影响需评估。GTAC还提供无需遗传操作探测GPCR信号和功能的平台，FLAG GTAC在缺乏靶特异性结合剂时有用，并可剖析空间组织GPCR信号，且不依赖β-arrestin招募。GTAC不消除高质量GPCR结合剂需求，但降低对内在拮抗活性的要求；占位抑制与降解不必互斥。总体而言，研究人员的发现将GTACs定位为GPCR调节策略库中的一种独特补充。尽管需要进一步研究界定该方法的转化范围，但此处建立的原则为扩展细胞外靶向降解作为治疗模态和探测GPCR生物学的工具奠定了基础。