靶向CLPP–LETMD1轴：药理抑制CLPP稳定LETMD1促进脂肪产热并缓解肥胖

《Adipocyte》：Pharmacological inhibition of CLPP stabilizes LETMD1 to boost thermogenesis and alleviate obesity

　　

肥胖（obesity）构成严重的全球健康负担，激活脂肪产热（adipose thermogenesis）提供了有前景的治疗途径。然而，线粒体蛋白稳态（mitochondrial proteostasis）对产热调控的贡献仍未阐明。在此，研究人员将线粒体蛋白酶CLPP（caseinolytic peptidase P, CLPP）鉴定为脂肪产热的负性调控因子。药理学抑制CLPP活性可增强脂肪细胞中的产热程序。机制上，CLPP与LETMD1（LETM1 domain-containing protein 1, LETMD1）相互作用并在翻译后水平（post-translational level）促进其降解，而LETMD1稳定化是CLPP抑制所诱导产热效应所必需的。在体内，使用hinokiflavone药理学抑制CLPP活性可显著增强肥胖小鼠的能量消耗（energy expenditure）、减轻体重增加并改善胰岛素敏感性（insulin sensitivity）。总之，研究人员的研究确定了一个调控脂肪产热的CLPP–LETMD1调控轴，并强调抑制CLPP作为肥胖干预（obesity intervention）的潜在治疗策略。

肥胖（obesity）由能量摄入与消耗失衡驱动，已成为全球健康危机。传统热量限制策略长期依从性差且伴副作用，因此激活产热脂肪组织以刺激适应性产热成为有前景的治疗策略。线粒体是适应性产热的动力中心，该过程高度依赖严格的蛋白质量控制；线粒体蛋白稳态（mitochondrial proteostasis）依赖分子伴侣和蛋白酶网络协调蛋白导入、折叠和降解。线粒体基质蛋白酶CLPP（caseinolytic peptidase P, CLPP）与其伴侣CLPX形成CLPXP复合物，识别并降解未折叠或损伤蛋白，从而维持线粒体完整性；CLPP下调可导致线粒体功能障碍和细胞呼吸受损，且CLPP还可选择性降解特定调控蛋白。CLPP在癌症和神经退行性疾病中研究较多，但其在脂肪产热和肥胖中的作用仍未阐明。全身CLPP敲除小鼠结果复杂且似矛盾：CLPP缺陷可防止饮食诱导肥胖和胰岛素抵抗，却损害冷诱导适应性产热，提示CLPP缺失的代谢后果具组织依赖性，而脂肪组织内CLPP功能尚未解决。肥胖脂肪组织中CLPP表达被报道降低。因此，研究人员采用药理学抑制策略急性调节CLPP活性，研究其在脂肪产热中的功能和机制，以区分脂肪特异性功能与既往全身敲除表型，并评估治疗潜力。研究人员发现，药理学抑制脂肪细胞CLPP可促进脂肪棕色化并增加能量消耗；机制上，CLPP抑制稳定LETMD1（LETM1 domain-containing protein 1, LETMD1），从而增强产热基因表达。该研究建立脂肪CLPP活性与适应性产热之间的直接联系，鉴定CLPP为肥胖及相关代谢病的有前景药理靶点。

为开展研究，研究人员用到的主要关键技术方法包括：人类脂肪组织数据来自公共数据集GSE70353；小鼠为C57BL/6J（购自SLAC，上海），采用正常饮食（normal diet, ND）和高脂饮食（high-fat diet, HFD）模型；原代米色脂肪细胞来自健康雌性C57BL/6J小鼠6–8周皮下白色脂肪组织（scWAT）的血管基质部分（stromal vascular fraction, SVF）。关键技术包括ONC212和hinokiflavone药理调节、siRNA敲低Clpp/Letmd1、iWAT/BAT局部注射、HFD小鼠腹腔注射hinokiflavone 64天、CCK-8、RT-qPCR、Western blot、H&E、免疫组织化学（IHC）、红外热成像、代谢笼VO₂（oxygen consumption，氧消耗）、GTT/ITT；以及Co-IP/MS（co-immunoprecipitation combined with mass spectrometry，免疫共沉淀联合质谱）、AlphaFold分子对接、Co-IP验证、CHX（cycloheximide，环己酰亚胺）chase和MG132（蛋白酶体抑制剂）实验；统计使用GraphPad Prism 9。

研究结果如下。

脂肪CLPP表达在小鼠和人类中与肥胖负相关。研究人员利用公共数据集GSE70353分析人类脂肪组织CLPP mRNA与多种体成分指标的相关性，发现CLPP表达与BMI（body mass index，体质指数）呈负相关（r=?0.196，p=4.08×10^?8），与WHR（waist-to-hip ratio，腰臀比）呈负相关（r=?0.185，p=2.25×10^?7），与lean mass呈正相关（r=0.181，p=4.2×10^?7）。在HFD诱导肥胖小鼠中，iWAT（inguinal subcutaneous white adipose tissue，腹股沟皮下白色脂肪组织）和BAT（brown adipose tissue，棕色脂肪组织）中CLPP蛋白较ND组显著下调。结论：人和小鼠中脂肪CLPP表达与肥胖相关表型存在方向一致的负相关。

CLPP在体外调控脂肪细胞产热而不影响脂质合成或成脂分化。原代米色脂肪细胞中，CLPP激活剂ONC212在低于2 μM时不影响细胞活力；贯穿分化过程处理ONC212，不改变核心成脂调节因子Pparg、Cebpa及脂质合成基因Fasn、Acc1、Scd1的mRNA水平，但显著下调产热基因Ucp1、Prdm16、Pgc1α、Cox8b及UCP1（uncoupling protein 1，解偶联蛋白1）蛋白。hinokiflavone在不超过30 μM时对原代米色脂肪细胞无毒，不显著改变成脂或脂质合成基因，但显著上调多个产热基因mRNA并增加UCP1蛋白。siRNA介导的Clpp敲低同样增强产热基因表达和UCP1蛋白。药理与遗传互作实验显示，ONC212对产热基因的抑制在Clpp敲低后消失；hinokiflavone对产热基因的增强在Clpp敲低后不再进一步增加。结论：CLPP负调控脂肪细胞产热基因表达，且不影响成脂分化或脂质合成，ONC212与hinokiflavone的产热效应主要依赖CLPP状态。

CLPP在体内调控脂肪产热。研究人员向小鼠iWAT和BAT局部注射ONC212或hinokiflavone。局部给予ONC212显著降低iWAT和BAT中UCP1蛋白表达、Ucp1 mRNA水平及组织表面温度；hinokiflavone注射则产生相反效应，显著增加UCP1蛋白、Ucp1 mRNA及组织表面温度。结论：CLPP在iWAT和BAT中均作为产热负调控因子发挥作用。

CLPP通过促进LETMD1降解调控脂肪细胞产热。研究人员在脂肪细胞中通过Co-IP/MS鉴定CLPP相互作用蛋白，以unique peptide count为筛选标准，发现LETMD1为候选互作蛋白。分子对接预测CLPP与LETMD1存在潜在结合界面，Co-IP实验验证二者物理互作。Clpp敲低不改变Letmd1 mRNA水平；CLPP过表达显著降低LETMD1蛋白丰度，CHX chase显示Flag-CLPP过表达使LETMD1蛋白在12 h CHX处理期间下降更快；MG132未阻止Flag-CLPP诱导的LETMD1降低，提示CLPP促进LETMD1降解主要独立于经典蛋白酶体途径。挽救实验显示，同时敲低Letmd1可显著减弱Clpp沉默诱导的产热基因表达上调和UCP1蛋白增加。结论：LETMD1是CLPP调控脂肪细胞产热的重要下游效应因子，CLPP在翻译后水平负向调控LETMD1稳定性。

Hinokiflavone治疗改善饮食诱导的肥胖。HFD小鼠每3天腹腔注射hinokiflavone 1 mg/kg，共64天。安全性初步评估显示，与vehicle对照相比，hinokiflavone处理小鼠肝重/体重比、血清ALT（alanine aminotransferase，丙氨酸氨基转移酶）、AST（aspartate aminotransferase，天冬氨酸氨基转移酶）水平及肝脏H&E染色均无明显异常。代谢评估显示，hinokiflavone处理组体重增加显著减慢，每日食物摄入无变化；iWAT、BAT和EPI（epididymal white adipose tissue，附睾白色脂肪组织）相对重量均显著降低；全身VO₂显著升高；iWAT和BAT脂肪细胞肥大减轻；iWAT和BAT中UCP1蛋白表达及Ucp1 mRNA水平升高；ITT（insulin tolerance test，胰岛素耐量试验）显示胰岛素敏感性改善，但GTT（glucose tolerance test，葡萄糖耐量试验）未显示全身体葡萄糖耐量显著改善。结论：hinokiflavone增强系统能量消耗、减轻体重增加并改善胰岛素敏感性，但不改变食物摄入，且未显著改善葡萄糖耐量。

讨论部分总结：脂肪产热是全身体能量消耗的重要组成部分，并被视为对抗肥胖及相关代谢并发症的潜在策略。线粒体蛋白稳态是适应性产热和系统能量平衡的基本检查点，但线粒体蛋白酶在脂肪组织中的作用仍定义不足。CLPP作为核心线粒体基质蛋白酶，参与多种病理，但其在脂肪产热和肥胖中的生理功能因系统性遗传模型结果矛盾而存在争议。研究人员发现，HFD诱导肥胖小鼠脂肪组织中CLPP蛋白水平降低，提示肥胖相关脂肪CLPP表达下降；而CLPP功能缺失显著上调棕色和米色脂肪细胞中UCP1及其他产热基因，并增强产热能力。肥胖中CLPP表达下降看似与CLPP负调控产热矛盾，但研究人员讨论认为，肥胖时交感/β肾上腺素反应受损、线粒体功能障碍、慢性炎症和脂肪组织重塑共同限制产热功能，CLPP降低可能代表内源性适应反应，部分缓解一层抑制压力，但不足以逆转更广泛的产热缺陷；进一步Clpp敲低或hinokiflavone处理可显著增强UCP1表达和产热能力。该结论与全身Clpp缺失小鼠防止饮食诱导肥胖但损害冷诱导产热和BAT白化看似冲突；研究人员认为差异可能来自CLPP扰动程度、持续时间和组织分布不同：急性药理抑制和细胞敲低不同于终身全身缺失，提示存在治疗窗，适度CLPP抑制促进产热，而完全消融超出线粒体蛋白稳态能力并触发BAT功能障碍。机制上，LETMD1是既往参与棕色脂肪组织完整性和适应性产热的线粒体调节因子，被鉴定为CLPP候选互作蛋白和CLPP依赖性产热调控的重要下游效应因子；CLPP物理互作并翻译后调控LETMD1稳定性而不影响转录，CLPP过表达降低LETMD1蛋白，CLPP抑制稳定LETMD1，挽救实验证明LETMD1对CLPP抑制诱导的产热激活严格必需。系统层面，hinokiflavone减少体重增加、增加全身体能量消耗、减小脂肪细胞大小并改善胰岛素敏感性，且不改变食物摄入；但全身代谢反应可能不限于脂肪组织，肝、骨骼肌或其他代谢组织的贡献不能排除。研究局限包括：缺乏脂肪特异性Clpp敲除模型，无法确定系统代谢效应完全归因于脂肪CLPP，且ONC212和hinokiflavone具有多效性药理特性，可能存在CLPP非依赖效应；长期持续药理学调节CLPP相关通路的安全性，尤其对心脏、内耳和生殖系统等高线粒体需求组织，尚需系统评估；研究不能确定肥胖相关CLPP表达降低是否伴随其蛋白酶活性相应变化；CLPP-LETMD1相互作用的分子基础及LETMD1是否被CLPP直接蛋白酶解尚待建立；体内研究仅使用雄性C57BL/6J小鼠，限制系统代谢发现对两性的普适性，CLPP–LETMD1轴及其相关代谢效应需在雌性队列中进一步研究。

研究结论翻译：总之，研究人员的研究确定了一个调控脂肪产热的CLPP–LETMD1调控轴，并强调抑制CLPP作为肥胖干预的潜在治疗策略。