《Nutrients》：Maternal Obesity Induces DNA Methylation Changes in the Kidneys and Blood of Rodent Offspring at Adulthood
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目的：利用母体肥胖小鼠模型，鉴定肥胖母鼠与瘦母鼠子代中的差异甲基化基因（differentially methylated genes, DMGs）。背景：胎儿发育期间的不良条件使子代易患成年期疾病，支持胎儿编程（fetal programming）理论。DN
目的：利用母体肥胖小鼠模型，鉴定肥胖母鼠与瘦母鼠子代中的差异甲基化基因（differentially methylated genes, DMGs）。背景：胎儿发育期间的不良条件使子代易患成年期疾病，支持胎儿编程（fetal programming）理论。DNA甲基化（DNA methylation）被认为是母体肥胖诱导胎儿编程的一种机制。由于母体肥胖使子代易患慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD），研究人员旨在探究DNA甲基化在母体肥胖相关子代CKD中的作用。方法：通过给雌性C57BL/6小鼠在配种前、妊娠期和哺乳期喂食高脂饮食（high-fat diet, HFD）建立母体肥胖模型。对照母鼠接受普通饲料（chow）。雄性子代于出生后第20天断奶并改喂普通饲料，在32周龄（成年期）处死。另一队列在出生时处死。采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）鉴定成年期和出生时子代肾脏与血液中的DMGs。采用实时PCR（real-time PCR）检测基因表达。结果：肥胖母鼠的成年子代在成年期肾脏和血液中均显示显著DMGs，并与肾脏损伤水平增加相关。其中，10个基因在肾脏中差异甲基化，其中4个基因也在血液中差异甲基化。另有10个基因仅在血液中差异甲基化。四个基因（Rcsd1、Cdk8、Taco1和Axin2）的肾脏mRNA表达显著上调，证实这些基因由于表观遗传调控而发生转录改变。通路分析显示Wnt经典信号通路（Wnt canonical signalling pathway）相关基因富集。相比之下，在第1天未检测到显著DMGs。结论：母体肥胖诱导成年子代肾脏与血液中差异基因甲基化。其中若干基因与肾脏纤维化、糖尿病或肥胖高度相关，支持表观遗传调控在母体肥胖致CKD胎儿编程中的作用。
研究背景与问题：近期研究已确立母体肥胖是子代晚年发生慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）的重要风险因素，这符合胎儿编程（fetal programming）理论，即子宫内不良暴露使胎儿易患成年期慢性疾病。研究人员此前利用啮齿类母体肥胖模型发现，妊娠期暴露于母体肥胖的子代在成年期出现CKD特征，包括白蛋白尿、肾小球硬化和肾脏纤维化，并伴有肾脏氧化应激和炎症增加。表观遗传修饰是影响基因表达而不改变DNA序列的可遗传改变，包括DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白修饰和RNA干扰。其中DNA甲基化研究最广泛，可响应饮食等环境应激，且哺乳动物DNA甲基化多数发生于子宫内胎儿发育关键期，因此被提出是成年慢性疾病胎儿编程的机制之一。动物和人类研究已发现肥胖与瘦母亲子代DNA甲基化差异，例如小鼠母体肥胖模型第8周子代肝脏存在差异甲基化基因，人类研究也发现母体肥胖与新生儿及青少年血液DNA甲基化位点相关。然而，母体肥胖对子代肾脏DNA甲基化的影响此前尚未见报道，直到研究人员近期研究显示母体肥胖使第32周子代肾脏全局DNA甲基化上调。鉴于CKD病例与对照者肾脏和血液中存在差异甲基化基因，研究人员提出假说：肥胖母亲子代肾脏中发生的DNA甲基化改变可能与成年期CKD相关，并旨在鉴定母体肥胖成年子代与对照子代之间的差异甲基化基因，同时检测出生时子代DNA甲基化。
研究人员开展了小鼠母体肥胖模型研究，得出母体肥胖诱导成年子代肾脏和血液中差异基因甲基化，这些改变与肾脏损伤增加相关，并富集于Wnt信号通路等，支持表观遗传调控参与母体肥胖所致CKD胎儿编程。该研究重要意义在于首次在肾脏组织中报道母体肥胖诱导的子代DNA甲基化改变，提示若干差异甲基化基因与CKD、纤维化、糖尿病、肥胖和脂质代谢高度相关，为母体肥胖相关CKD的发育起源提供表观遗传线索。
关键技术方法：动物实验经Northern Sydney Local Health District动物伦理委员会批准（Resp/17/29），在Kearns Animal Facility进行。8周龄雌性C57BL/6小鼠随机接受高脂饮食（high-fat diet, HFD）或普通饲料（chow），14周龄配种并在妊娠和哺乳期维持饮食；雄性子代第20天断奶至普通饲料，32周龄处死，另一队列出生第1天处死；每个生物学重复来自不同母鼠/窝。采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）检测肾脏和全血DNA甲基化；实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测肾脏mRNA表达；尿白蛋白/肌酐比（urinary albumin:creatinine ratio, UACR）和肾脏组织学评估肾损伤；并进行通路富集分析。
研究结果：
母体HFD诱导子代肾脏损伤：HFD喂养母鼠所生雄性子代在32周体重无变化，但肾脏重量/体重比显著增加，UACR显著增加，并伴肾小球硬化和肾小管间质损伤复合指数增加。
第32周肾脏差异甲基化基因：肾脏中共10个基因甲基化状态显著差异。3个基因显著高甲基化，包括2810004N23Rik、Rnf150和Cdon；7个基因显著低甲基化，包括Rcsd1、Cdk8、Pex2、Taco1、Axin2、1700030C10Rik和Gm20110。其中Axin2差异甲基化位点最多（9个），Cdk8和Pex2各8个；Rnf150、2810004N23Rik、Cdon、Taco1和Gm20110为单一位点差异。
第32周血液差异甲基化基因：血液中共14个基因显著差异。8个高甲基化：2810004N23Rik、Arhgef26、Ets1、Cdk8、Gm28590、Cylc1、H2-Q6和Tmtc2；6个低甲基化：Rcsd1、Pex2、Pcdh7、SOCS3、B230209E15Rik和A630010A05Rik。SOCS3、Cdk8、Rcsd1和Arhgef26在多个位点差异甲基化。肾脏与血液共有4个差异甲基化基因：Rcsd1、Cdk8、Pex2和2810004N23Rik；其中Rcsd1、Pex2和2810004N23Rik甲基化方向一致。
仅在肾脏差异甲基化基因的mRNA表达：Rnf150肾脏mRNA表达在两组间相似；肥胖母鼠子代肾脏Taco1和Axin2 mRNA表达显著增加；1700030C10Rik、Gm20110和Cdon肾脏mRNA表达相似。
肾脏和血液共同差异甲基化基因的mRNA表达：肥胖母鼠子代肾脏Rcsd1和Cdk8 mRNA表达显著增加；Pex2 mRNA表达有增加趋势但未达统计学显著；2810004N23Rik肾脏mRNA表达两组相似。
第32周通路分析：肾脏差异甲基化基因在基因本体水平显著富集于Wnt信号调节相关通路；血液富集于炎症反应和脂质代谢通路；共同通路提示血液和肾脏均有过氧化物酶体调节。KEGG分析也提示子代肾脏中Wnt信号和过氧化物酶体调节呈适度富集，而血液中1型和2型糖尿病相关通路显著。
出生后第1天DNA甲基化与第32周比较：第1天子代肾脏和血液中均无显著差异甲基化基因（FDR > 0.05）。但第32周显著基因在第1天显示一致甲基化方向：肾脏中Axin2、Cdk8、Pex2、1700030C10Rik、Rcsd1和Gm20110呈低甲基化；血液中Cdk8、Arhgef26、Gm28590、Tmtc2、2810004N23Rik、H2-Q6、Cylc1和Ets1呈高甲基化倾向；SOCS3呈低甲基化倾向。
第1天通路分析：第1天肾脏前100位差异甲基化基因富集于肾脏发育相关通路，包括肾单位小管形成、中肾小管/上皮发育、输尿管芽发育、肾脏/肾系统发育和肾上皮发育；血液则富集于主动脉瓣形态发生、心脏瓣膜形态发生、树突形态发生、VEGF信号和脂质代谢。KEGG显示肾脏也富集Wnt信号，与第32周一致，Foxo信号也受调控；血液中氨基酸和脂质代谢通路占主导，包括色氨酸、精氨酸/脯氨酸、组氨酸、脂肪酸降解和胆固醇代谢。
讨论部分总结：研究人员在本研究中证明，母体肥胖诱导成年小鼠子代肾脏和血液DNA甲基化改变，并与肾脏损伤增加相关。通路分析显示第32周血液中炎症和代谢通路显著富集，子代肾脏中Wnt信号显著富集；第1天DNA甲基化谱提示肾脏和心血管系统及脂质代谢富集。这些发现支持DNA甲基化在子代成年CKD发育编程机制中发挥作用。DNA甲基化谱通常由基因组和环境因素相互作用决定，本研究中新生儿暴露于母体HFD是修饰因素。子代在妊娠和哺乳期暴露于母体HFD后断奶至普通饲料，因此母体肥胖所致修饰需持续至成年才能介导CKD。第32周肾脏和血液分别有10和14个显著差异甲基化基因，而出生第1天无显著差异甲基化基因，反映DNA甲基化是动态过程，不太可能从青春期至成年保持不变；间接机制和小样本量也可能导致第1天缺乏显著变化。尽管如此，第32周较大比例差异甲基化基因在第1天显示相同方向，且第1天前100位差异甲基化基因通路分析识别出若干第32周也显著的通路，提示早期DNA甲基化改变可能在通路水平发生并在成年期持续或复现，但需更大队列研究确认。Wnt信号相关通路在肾脏第1天和第32周、基因本体和KEGG分析中均显著，支持某些与母体肥胖胎儿编程相关的表观遗传性状在子代肾脏维持至成年并促成CKD。Axin2作为Wnt通路关键负反馈调节因子，在母体肥胖子代肾脏中DNA甲基化下调且mRNA表达上调。Cdon是参与经典Wnt信号通路的细胞黏附蛋白，对该信号级联具有抑制作用，本研究中Cdon高甲基化并伴mRNA增加趋势。肾损伤时Wnt通路通常激活以促进组织再生，Axin2和Cdon mRNA增加可能抑制该机制，导致适应不良修复。其他研究显示Axin2在单侧输尿管梗阻模型和糖尿病肾小球硬化中肾脏表达显著增加。Cdk8在肾脏和血液中均差异甲基化，但肾脏低甲基化、血液高甲基化；这种差异并不意外，因为CDKs在细胞分化和增殖中发挥作用，而成熟循环血细胞不发生这些过程。肾脏Cdk8低甲基化与mRNA表达增加相关。Cdk8可磷酸化Notch胞内结构域并激活Notch信号，研究人员此前证明Notch信号参与肾脏纤维化；Notch信号在肾脏发育中关键，成熟后通常沉默，啮齿类模型中肾脏发育后持续Notch激活与肾小管间质纤维化、肾小球硬化和白蛋白尿相关，故肾脏Cdk8甲基化降低支持其通过Notch通路激活参与肾脏纤维化。Cdk8还磷酸化并抑制固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs），后者调节脂质合成基因表达，并参与肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化、CKD和非酒精性脂肪肝发病机制。Taco1、Rscd1和Pex2是其他肾脏低甲基化且mRNA表达增加的基因。Taco1参与线粒体呼吸，编码细胞色素c氧化酶亚基I翻译和合成所需蛋白；Rcsd1调节肌动蛋白丝结合，对细胞迁移、摄食和分裂关键；Pex2编码过氧化物酶体膜蛋白，参与过氧化物酶体生物合成，而过氧化物酶体对脂质氧化代谢关键。Rscd1通常见于免疫细胞，其肾脏表达增加可能提示肾脏组织免疫细胞浸润，但研究人员此前同一模型未发现肾脏炎症标志物MCP-1和CD68 mRNA显著变化；该研究确实显示氧化应激标志物表达显著增加，与Pex2上调一致。Rscd1和Pex2在肾脏和血液中甲基化与mRNA方向相同，支持相同调控机制，但其参与肾病发育起源的确切机制尚待阐明。第32周差异甲基化CpG位点中若干属于非编码区域，包括1700030C10Rik、Gm20110、B230209E15Rik、A630010A05Rik和Gm28590。未检测到2810004N23Rik、1700030C10Rik和Gm20110肾脏mRNA表达变化，提示这些甲基化位点不调控转录表达；若干显著差异甲基化基因功能与CKD、糖尿病或肥胖无关，其意义尚不明确，需进一步研究。局限性包括样本量相对较小，尽管仍显示多个基因高度显著甲基化差异，未来需更大队列验证；虽然研究人员此前证明肥胖母鼠子代易患CKD，当前研究中母体肥胖所致甲基化差异提示母体肥胖通过这些机制编程CKD，未来敲低模型可帮助识别候选基因在母体肥胖胎儿编程CKD中的作用；甲基化分析组织（肾皮质和全血）由多种细胞类型组成，异质性细胞混合物可能混淆DNA甲基化结果，取决于细胞类型比例，可进行去卷积研究调整，但超出当前研究范围，可作为未来重点。
研究结论翻译：研究人员对小鼠肾脏和血液样本的分析显示，暴露于母体肥胖的子代与对照子代在成年期存在高度显著的基因甲基化差异，这些差异与Wnt信号通路（Wnt signalling pathway）相关。母体肥胖诱导的子代DNA甲基化改变此前尚未在肾脏组织中被报道。经文献回顾，若干差异甲基化基因与CKD、纤维化、糖尿病、肥胖和脂质代谢高度相关，支持以下假说：这些基因的表观遗传调控可能参与母体肥胖所致CKD的胎儿编程（fetal programming）。需要在更大队列和人类组织中进行进一步研究以确认该机制。
