《International Journal of Molecular Sciences》：Features of Complementary Interactions of BmiRNAs with mRNAs of Human Genes
编辑推荐：
自人类细胞中发现miRNAs以来，已过去三十余年，但其许多生物学特性仍未得到充分理解。本研究旨在探究miRNAs能否通过完全互补碱基配对与靶基因mRNAs相互作用。利用MirTarget程序，研究人员证明了所有miRNAs的核苷酸均可与靶基因mRNAs的核苷酸
自人类细胞中发现miRNAs以来，已过去三十余年，但其许多生物学特性仍未得到充分理解。本研究旨在探究miRNAs能否通过完全互补碱基配对与靶基因mRNAs相互作用。利用MirTarget程序，研究人员证明了所有miRNAs的核苷酸均可与靶基因mRNAs的核苷酸形成完全互补的相互作用。研究分析了Backes等人鉴定并命名为BmiRNAs的共1036个miRNAs，以及来自17508个人类基因的mRNAs，揭示了若干重要特征。绝大多数BmiRNAs被发现可与靶基因mRNAs的3′-非翻译区（3′UTRs）完全互补结合。许多mRNAs含有多个BmiRNAs的结合位点（BSs），形成结合位点簇，在此簇中BmiRNAs可能竞争与同一mRNA的相互作用。研究还鉴定了多达四个BmiRNAs组成的相同组合，这些组合能够结合不同基因的mRNAs。此外，还鉴定出mRNAs含有多达八个BmiRNA结合位点的基因。这些发现拓宽了研究人员对BmiRNAs在mRNA翻译阶段调控人类基因表达机制的理解，并为其在转录后基因调控中的潜在作用提供了新见解。
论文解读
一、研究背景与问题
微小RNA（microRNA，miRNA）自三十余年前在人类细胞中被发现以来，一直是分子生物学领域的研究热点。尽管研究历史悠久，但miRNAs的许多生物学特性至今仍未得到充分阐明。传统观点认为，miRNA与靶基因mRNA的识别主要取决于miRNA 5′端一段8–9个核苷酸的种子序列（seed region），基于这一概念的早期预测算法鉴定出了大量潜在靶基因。然而，随着人类基因组测序完成，基于种子序列的靶基因预测数量急剧膨胀，引发了学界对种子预测方法特异性的广泛质疑。相比之下，聚合酶链反应（PCR）等技术通常依赖至少20个核苷酸的引物来实现高度特异的序列识别。这一对比凸显了传统miRNA靶标预测方法在特异性方面的固有缺陷。
正因如此，尽管过去三十年间对miRNA-mRNA相互作用开展了大量研究，但建立明确且高度特异的miRNA-靶标关系始终面临挑战。这一局限性也影响了基于miRNA的疾病预测生物标志物的开发，以及miRNA研究向肿瘤和心血管疾病有效治疗应用的转化。在此背景下，本研究旨在系统探究BmiRNAs能否通过完全互补的碱基配对与人类基因mRNAs发生相互作用，从而为miRNA靶标识别提供一种更为严谨和特异的分析框架。
二、研究目的与意义
本研究的核心目的在于确定哪些已知BmiRNAs能够与哪些基因的mRNAs发生完全互补的相互作用。这一研究方向的提出基于一个重要理论依据：双链DNA或RNA中核苷酸的相互作用早已被证实，因此miRNA与mRNA之间的完全互补配对在物理化学层面具有充分的理论基础，湿实验验证的必要性可能被过度强调。该研究的意义在于建立每个BmiRNA与其靶基因之间的明确对应关系，并反向确定调控特定基因表达的具体BmiRNA，为深入理解miRNA介导的翻译调控机制奠定基础。
三、主要技术方法
研究人员从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库下载了17508个人类基因的核苷酸序列，计算时选用了核苷酸序列最长的基因异构体。BmiRNAs的核苷酸序列取自Backes等人建立的数据库，共1036个。核心分析工具为MirTarget程序，该程序可预测miRNA与mRNA相互作用的以下特征：miRNA从mRNA第一个核苷酸起始的结合位置；结合位点在mRNA 5′非翻译区（5′UTR）、编码区（CDS）和3′非翻译区（3′UTR）中的定位；miRNA与mRNA之间核苷酸相互作用的示意图；以及相互作用吉布斯自由能（ΔG，kJ/mol）。每个位点计算ΔG/ΔGm比值，其中ΔGm为miRNA与其完全互补的经典核苷酸序列结合的自由能。分析仅选取以经典配对（G-C和A-U）方式相互作用的miRNAs。
四、研究结果
2.1 四个BmiRNAs与mRNA的结合
研究人员发现，BmiR-1441-3p、BmiR-2164-3p、BmiR-1189-3p和BmiR-2289-3p四个BmiRNAs可竞争性结合AASS基因mRNA 3′UTR中的结合位点簇，该簇起始于第3261位核苷酸。其中BmiR-1441-3p的预测结合自由能（ΔG）为?123 kJ/mol，其余三个均为?113 kJ/mol，表明BmiR-1441-3p具有更强的结合亲和力。这四种BmiRNAs被预测可竞争性结合33个靶基因的mRNAs。值得注意的是，AP3M1和CENPI基因mRNAs的5′UTR中含有这些结合位点，而BEND2基因mRNA的CDS中含有全部四个BmiRNAs的结合位点。该BmiRNA组的共同特征在于所有成员均来源于前体发夹结构的3′臂（BmiRNA-3p）。
2.2 三个BmiRNAs与mRNA的结合
三个BmiRNAs组成的组合比四个的组合更为常见。BmiR-531-5p、BmiR-1641-5p和BmiR-1608-5p组合被预测靶向131个人类基因的mRNAs，其中DFFA、KCNA7和UBE2G2基因mRNAs各含有两个结合位点簇，簇间距离分别为302、413和1037个核苷酸。ADAL基因mRNA的5′UTR中含有这三个BmiRNAs的结合位点。该组合的共同特征是所有成员均来源于前体发夹结构的5′臂（BmiRNA-5p）。另一组合BmiR-1441-3p、BmiR-1189-3p和BmiR-2289-3p被预测在45个靶基因mRNAs中形成结合位点簇，其中POU5F1基因mRNA的5′UTR和LOC100996基因mRNA的CDS中各含一个结合位点簇。BmiR-1441-3p、BmiR-2164-3p和BmiR-1189-3p组合则预测结合21个靶基因的mRNAs，其中CHP1基因mRNA含有两个相距344个核苷酸的结合位点簇。
2.3 单个BmiRNA的结合
部分BmiRNAs的结合位点位于结合位点簇之外，可在无其他BmiRNAs直接竞争的情况下调控靶基因表达。BmiR-754-5p被预测与69个靶基因mRNAs相互作用，有趣的是，在表格所列以字母G开头的基因mRNAs中未发现其结合位点。在所有分析的BmiRNAs中，BmiR-531-5p具有最广泛的预测靶标谱，在404个人类基因mRNAs中鉴定到结合位点。ORAI2基因mRNA尤为突出，含有17个BmiRNA结合位点，包括六对BmiR-531-5p和BmiR-1641-5p的重叠结合位点对。此外，多个基因mRNAs含有大量不同BmiRNAs的结合位点，如CFLAR、CYP20A1、FKBP5和NMT2基因mRNAs各含有八个结合位点，PARD6B和SLC9A7基因mRNAs各含有八个结合位点并分为三个簇。
2.4 BmiRNA-5p和BmiRNA-3p的结合
研究人员鉴定了一对罕见的BmiRNA配对相互作用：BmiR-2455-5p和BmiR-2455-3p均被预测结合CACNA2D4基因mRNA，其结合位点分别位于5′UTR和3′UTR，相距38个核苷酸。类似模式也见于BmiR-864-3p/BmiR-864-5p配对，其结合位点位于ARGLU1基因mRNA的CDS中。
五、讨论与结论
讨论部分指出，BmiRNAs能够抑制靶基因mRNA的翻译，但存在若干难以解释却必然存在的特性。结合位点簇仅结合具有相同前体来源的BmiRNAs，即仅含BmiRNA-5p或仅含BmiRNA-3p。BmiRNAs与Argonaute蛋白的结合通过静电相互作用介导，因Argonaute蛋白富含正电荷氨基酸。与Argonaute结合的BmiRNA通过氢键沿其全长序列与mRNA相互作用，该相互作用能量高于静电相互作用，从而决定过程方向及BmiRNA-mRNA复合物的稳定性。目前尚不清楚结合位点簇如何区分BmiRNA-5p和BmiRNA-3p，推测二者可能具有相反的螺旋结构。多个BmiRNAs在同一结合位点簇内结合的现象提示翻译抑制机制的冗余性，而相同BmiRNA组合结合多个基因mRNAs的现象则可能表明该组合对这些基因具有协同调控功能。
结论部分强调，本研究结果显著拓展了对所研究BmiRNAs功能特性的认识，与其它以完全互补方式与多基因mRNAs相互作用的BmiRNAs数据相结合，证明了BmiRNAs在调控人类基因组蛋白质编码区表达中的重要作用。本研究最关键的成果在于建立了每个BmiRNA与其靶基因之间的明确对应关系，并提供了miRNA-mRNA相互作用的定量特征，明确了哪些miRNAs之间存在竞争关系。这些数据将极大加速对单个miRNAs及miRNA组合功能角色的阐明。
