氧化平衡评分相关CpG位点的跨物种年龄相关甲基化动态：基于韩国基因组与流行病学研究队列的进化表观遗传学分析

《International Journal of Molecular Sciences》：Organelle-Selective Autophagy in Cancer Immunotherapy: Mitophagy and Nucleophagy-Related Nuclear Quality Control as Regulators of Tumor–Immune Interactions

氧化平衡评分（Oxidative Balance Score, OBS）综合了与氧化还原稳态相关的饮食和生活方式暴露因素，但OBS相关的表观遗传标记物的进化行为仍不清楚。在本研究中，研究人员在韩国基因组与流行病学研究（Korean Genome and Epidemiology Study, KoGES）队列中开展了一项协变量校正的全表观基因组关联研究（Epigenome-Wide Association Study, EWAS），校正了OBS和细胞类型比例。研究人员鉴定了26个稳健的OBS相关CpG位点。随后将这些位点映射至哺乳动物甲基化联盟数据集（GSE223748），并以时间年龄（chronological age）作为累积氧化负担的代理指标，考察了其在九个哺乳动物物种中的年龄相关甲基化动态。跨物种分析显示，人类的相关模式仅部分保留，灵长类动物中的一致性高于若干非灵长类物种。此外，1000次迭代自助重采样和零模型敏感性分析（Robinson-Foulds距离）表明，这26个CpG位点的物种间聚类拓扑结构具有统计学稳健性，且不同于随机基因组噪声。这些发现提示，人类OBS相关位点的年龄相关甲基化行为存在部分进化保留，为氧化还原相关的表观遗传动态提供了一个比较框架。

论文解读：氧化平衡评分相关CpG位点的跨物种年龄相关甲基化动态——基于KoGES队列的进化表观遗传学分析

一、研究背景与科学问题

氧化应激是活性氧（ROS）产生与生物系统解毒能力之间失衡所导致的病理状态，被广泛认为是衰老的标志以及多种人类疾病（包括心血管疾病、神经退行性疾病和代谢综合征）的核心致病机制。低水平ROS作为细胞稳态的关键信号分子发挥生理功能，而慢性超生理水平的ROS则导致大分子损伤、炎症和细胞衰老。为在临床和流行病学场景中评估这一复杂的生理状态，氧化平衡评分（OBS）作为一种综合性工具被提出，它整合了多种膳食促氧化/抗氧化成分以及生活方式因素（如吸烟、体力活动），用以量化个体整体氧化还原状态。较高的OBS与全因死亡率降低、端粒延长和癌症风险降低相关。

然而，将这些环境氧化暴露转化为长期生理结局的分子机制尚未完全阐明。DNA甲基化作为环境与基因组之间的界面，可被氧化应激直接重塑：氧化应激通过抑制DNA甲基转移酶（DNMT）活性或促进TET酶向损伤位点募集，形成随时间持续存在的"表观遗传疤痕"。尽管已有特定CpG位点被鉴定为累积氧化损伤的生物标志物，且GrimAge等表观遗传时钟利用吸烟相关甲基化指标高精度预测寿命，但一个根本性的生物学问题仍然存在：调控氧化还原平衡的表观遗传机制是人类特有的，还是哺乳动物生存所必需的进化保守特征？基于衰老进化理论中"可弃躯体"假说（长寿命物种在体细胞维持和修复上投入更多能量），研究人员推测人类特异性的氧化应激表观遗传调控可能与其延长寿命相关。比较表观遗传学为此提供了有力工具，通过分析不同哺乳动物物种的DNA甲基化，可区分潜在保守的年龄相关表观遗传轨迹与物种特异性适应。

二、研究内容与主要结论

本研究开展了一项多阶段进化表观遗传学分析。首先，在韩国基因组与流行病学研究（KoGES）的安山-安城（ASAS）队列中，通过协变量校正的全表观基因组关联研究（EWAS），在校正OBS和血细胞类型比例后，鉴定出26个稳健的OBS相关CpG位点（男性12个，女性14个），满足严格的多重检验校正阈值（FDR < 0.05）。其次，利用哺乳动物甲基化联盟数据集（GSE223748），将这26个位点映射至九个哺乳动物物种，以时间年龄作为累积氧化负担的代理指标，追踪这些标记物的进化轨迹。研究发现：人类OBS相关CpG位点的年龄相关甲基化模式在哺乳动物中仅部分保留，灵长类（尤其是恒河猴）与人类的一致性较高，而若干非灵长类物种的一致性较弱；物种间聚类拓扑结构经1000次自助重采样和零模型敏感性分析验证具有统计学稳健性，且明显区别于随机基因组噪声；男性和女性的物种级聚类结构总体相似但并非完全相同，提示存在适度的性别相关差异。这些发现支持人类OBS相关甲基化信号存在部分进化保留，为氧化还原相关表观遗传衰老提供了比较框架。

三、关键技术方法

本研究采用多阶段分析流程。样本来源为KoGES的ASAS队列（450K甲基化芯片，n = 400），跨物种数据来自哺乳动物甲基化联盟数据集（GSE223748），涵盖九个物种：灵长类（人、恒河猴）、啮齿类（小鼠、大鼠）、食肉目（犬、猫）、奇蹄目（马）和偶蹄目（狍、绵羊）。主要技术方法包括：基于limma的协变量校正EWAS（校正OBS和血细胞类型比例）；Pearson和Spearman相关分析；自定义"Hybrid Pi-score（HyPi）"综合评分用于位点排序；Ingenuity Pathway Analysis（IPA）通路分析；主成分分析（PCA）和多维标度（MDS）降维；基于欧氏距离的邻接法（Neighbor-Joining）系统发育树构建；1000次自助重采样拓扑稳定性检验；以及基于Robinson-Foulds距离的零模型敏感性分析。

四、研究结果

4.1 基线特征与OBS相关CpG位点的鉴定

在ASAS队列中，研究人员通过协变量校正的线性回归模型（limma），在校正OBS和估计的细胞类型比例后，鉴定出26个高度稳健的OBS相关CpG位点（男性12个，女性14个），满足FDR < 0.05和名义p < 0.01的阈值。维恩图分析显示男性和女性之间无重叠位点（0.0%）；跨性别评估显示这些位点的甲基化动态严格以性别特异方式运作。多组学分析（31个TCGA癌症队列）揭示了多个位点的甲基化-表达反向关系，其中ZNF549在几乎所有评估的恶性肿瘤中均呈现普遍负相关，IRS1、LAMC2、MPPED2、PRKCE和EVX1在多种实体瘤中也观察到广泛的反向相关。此外，多个位点在死亡患者与存活患者之间、晚期（III/IV期）与早期（I/II期）肿瘤之间表现出显著的分子改变。IPA通路分析将注释基因映射至RAR激活、生长激素信号、前列腺癌细胞系转化和浆液性腺癌等通路。

4.2 OBS相关CpG位点的跨物种年龄相关相关性

利用哺乳动物甲基化联盟数据集，研究人员考察了26个人类OBS相关CpG位点在九个哺乳动物物种中的年龄相关甲基化相关性。跨物种热图显示，多个CpG位点在人以外的物种中保留了非零的年龄相关模式，但相关性的方向和幅度因物种和性别而异。Pearson和Spearman系数在物种内总体一致，在人类和恒河猴中尤为明显，CpG水平估计值紧密聚集在恒等线附近；而若干非灵长类物种表现出更宽的离散度，表明线性和秩次关联模式之间的一致性较低。

4.3 物种水平的相关性强度变异

物种水平的平均绝对相关系数分析显示，相关性强度在不同哺乳动物间存在差异，Pearson和Spearman趋势在性别内大致相似。箱线图进一步显示，在人类和恒河猴中，多个CpG位点在正负两个方向上均明显偏离零，而若干非灵长类物种的分布更集中于零附近，表明这些优先化CpG位点的年龄相关关联较弱或一致性较低。

4.4 与人类相关模式的趋同与分歧

将每个非人类物种的CpG水平相关谱与人类对应谱进行比较，恒河猴在多个分析面板中表现出与人类最大的视觉一致性，而若干非灵长类物种的回归趋势较平缓或一致性较低。重要的是，一致性在同一物种内并非对所有CpG位点相同，部分位点保留了人类模式，而其他位点则表现出显著分歧，支持不完全进化保守的模型。

4.5 物种水平相关谱的多变量结构与聚类

主成分分析（PCA）和多维标度（MDS）显示，物种在降维空间中占据部分分离的位置，表明这26个CpG位点的相关谱捕获了结构化的物种间变异而非随机噪声。基于欧氏距离构建的邻接法树显示了可识别的物种分组结构，1000次自助重采样支持核心分支结构，特别是灵长类谱系与非灵长类分支的分离。零模型敏感性分析中，从高度保守的37,000个哺乳动物CpG池中随机抽样大小匹配的CpG集1000次，计算Robinson-Foulds拓扑距离，真实拓扑明显区别于随机噪声分布，确认这26个位点驱动的物种间聚类捕获了与氧化还原稳态相关的特定进化轨迹。男性和女性的聚类结构经tanglegram比较显示总体相似但并非完全相同，提示适度的性别相关差异。

五、讨论与结论

讨论部分指出，跨物种结果支持人类OBS相关甲基化信号在哺乳动物中仅部分保守的观点。恒河猴与人类表现出最大的总体相似性，而若干非灵长类物种的一致性较弱，这与先前比较甲基化研究显示的年龄相关表观遗传架构同时包含保守和谱系依赖成分的结论一致。研究同时强调，由于跨物种分析依赖年龄作为代理指标而非物种特异性OBS，结果应解释为人类OBS相关CpG位点的年龄相关行为分析，而非OBS表型本身在所有哺乳动物中具有相同生物学意义的直接证据。IPA通路分析结果被定位为假设生成而非机制验证。性别分层分析中的差异被解释为适度的相关性架构变异而非性别特异性进化轨迹的确定证据。研究还讨论了非灵长类模型在比较表观遗传研究中的可转移性问题，以及探针杂交效率受序列漂移或物种特异性SNP影响的潜在技术局限。

结论部分总结：研究人员在KoGES队列中鉴定了26个与OBS相关的CpG位点，并证明这些人类优先化位点在哺乳动物物种间表现出异质性的年龄相关相关模式。总体模式在人类与恒河猴之间的相似性高于人类与若干非灵长类物种之间的相似性，与人类OBS相关甲基化信号的部分进化保守一致。这些发现支持将比较表观遗传分析作为区分相对保守与更多物种依赖性CpG位点的框架，同时也强调当以年龄作为代理指标跨物种评估人类表型相关标记物时需要谨慎解读。