整合多维生物信息学与计算毒理学构建磷酸三苯酯（TPHP）诱导自闭症谱系障碍（ASD）的不良结局通路（AOP）并识别芳基有机磷阻燃剂（OPFRs）经GAD1介导的神经发育毒性风险

《International Journal of Molecular Sciences》：Construction of Adverse Outcome Pathway (AOP) for Triphenyl Phosphate (TPHP)–Induced Autism Spectrum Disorder (ASD) and Risk Identification of Neurodevelopmental Toxicity of Aryl Organophosphorus Flame Retardants (OPFRs) Based on Multidimensional Bioinformatic Data

　　

磷酸三苯酯（TPHP）是一种被广泛使用的增塑剂和有机磷酸酯阻燃剂，广泛应用于多种工业产品和消费品。由于TPHP具有普遍的环境暴露，并已在羊水和母乳等人体样本中被检出，近年来因其对人类潜在神经发育影响而成为备受关注的污染物。本研究采用整合网络毒理学、转录组学、计算机基因敲除、分子对接和分子动力学模拟的多方法策略，探讨TPHP在自闭症谱系障碍（ASD）中的潜在毒性作用。所构建的不良结局通路（AOP）显示，TPHP暴露可能通过下调GAD1——编码GABA合成限速酶（谷氨酸脱羧酶）的核心基因——诱导并加重ASD，导致脑内兴奋-抑制失衡。对85种有机磷酸酯阻燃剂（OPFRs）（在人体和生物基质中广泛检出）与GAD1蛋白进行批量分子对接，鉴定出芳基OPFRs为靶向GAD1并诱导神经发育毒性的干扰物。总之，该研究为TPHP促进ASD进展提供了机制性见解，并为评估OPFRs的神经发育毒性提供了有价值的化学参考。

传统溴化阻燃剂（BFRs）逐渐被限制，有机磷酸酯阻燃剂（OPFRs）成为主要替代品，TPHP作为代表性OPFRs和增塑剂广泛用于工业与消费品。TPHP以物理方式添加，易通过挥发和机械磨损进入空气、土壤、灰尘、水体和沉积物，并已在毛发、胎盘、血液和尿液中检出，构成环境健康风险。已有研究提示TPHP具有内分泌干扰、肝毒性、神经发育毒性、生殖发育毒性和免疫毒性等。生命早期发育中的大脑对外源毒物尤为敏感，极低剂量暴露也可能造成持续神经行为损伤。ASD是高度异质性神经发育障碍，表现为沟通和社会行为受损，环境因素可贡献约40–50%的病因。额叶皮层是“社会脑”的关键组分，其异常被认为是ASD的重要特征。传统动物模型成本高、耗时长，难以应对大量化学品的毒性评估，因此研究人员采用计算毒理学和多维生物信息学方法，聚焦TPHP暴露与ASD，探索额叶皮层中潜在分子机制。研究人员整合ADMET、网络毒理学、转录组学、动物实验分析、机器学习、模拟基因敲除、分子对接和分子动力学模拟，构建以关键干预靶点为分子起始事件（MIE）的AOP，并对85种在人体和生物基质中广泛检出的OPFRs与关键靶点进行批量分子对接，以识别可经GAD1诱导神经发育毒性的OPFRs。研究结论表明，TPHP暴露可下调GAD1，扰乱GABA能突触信号，导致脑兴奋-抑制失衡，进而诱导并加重ASD；芳基OPFRs是靶向GAD1并产生神经发育毒性的干扰物。该研究为理解OPFRs健康风险及ASD环境干预提供了理论依据。
关键技术方法方面，研究人员基于ADMETlab 3.0评估TPHP的ADMET性质；从CTD、SEA、GeneCards和OMIM获取TPHP与ASD相关靶点；用STRING和Cytoscape 3.8.0构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络；使用GEO数据集GSE28521（GPL6883，额叶皮层，对照n=16、ASD n=16）和GSE113834（GPL15207，前额叶，对照n=12、ASD n=15）进行差异表达与ROC分析；建立C57BL/6J小鼠TPHP经口暴露队列（妊娠第6天至出生后第21天，0.1、1、10 mg/kg bw/day，取E15前脑，10 mg/kg组和对照各n=3）进行转录组测序；使用GSE203201单细胞数据（脑类器官培养第6、12、30、60、100天，对照n=7、实验n=7），经Seurat、Harmony和SingleR分析，并用scTenifoldKnk虚拟敲除GAD1；采用AutoDock/Vina分子对接、GROMACS分子动力学模拟和MM-PBSA计算；依据OECD手册构建AOP，并对85种OPFRs与GAD1批量对接。

研究结果如下。2.1 基于ADMETlab 3.0数据库评估TPHP的ADMET性质：TPHP在MDCK和Caco-2细胞中渗透性高，血浆蛋白结合率约98.897%，血浆游离分数约0.432%，可作为多种CYP底物的概率非零，清除率接近低清除标准，提示其高吸收、抗代谢、抗排泄，并可穿过血脑屏障（BBB），属于神经毒物。2.2 获取TPHP与ASD交集靶点：通过网络毒理学从CTD和SEA数据库获得9061个TPHP相关靶点，从GeneCards和OMIM获得3925个ASD相关靶点，交集得到1784个TPHP暴露相关ASD靶点。2.3 TPHP诱导ASD潜在靶点PPI网络分析与构建：使用STRING数据库（Homo sapiens，高置信度0.900）和Cytoscape 3.8.0分析，按degree>5筛选，从1371个靶点中去除852个，得到519个潜在核心靶点。2.4 GSE28521数据集额叶皮层差异表达分析：按|log₂FC|≥0.585且p<0.05，共鉴定69个差异表达基因（DEGs），其中48个上调、21个下调。2.5 网络毒理学与转录组学靶点交集及功能通路分析：交集得到LYN、PTGS2、MSN、GAD1、GAD2五个靶点；GO分析获得320个显著条目，KEGG获得8条通路，涉及异物刺激反应、神经递质生物合成、谷氨酸代谢、抑制性突触、谷氨酸结合、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、GABA能突触及NF-kappa B信号通路。2.6 核心靶点表达验证和ROC诊断效能：GSE28521中GAD1显著下调、GAD2上调但不显著，AUC分别为0.719和0.652；GSE113834中GAD1和GAD2均显著下调，AUC分别为0.767和0.744，提示GAD1具有较好诊断能力并进入后续分析。2.7 E15小鼠前脑TPHP跨代暴露转录组分析：PCA显示组间差异，共鉴定444个DEGs（297个上调、147个下调），GO获得888个条目，KEGG获得19条通路，涉及突触组织、突触可塑性调节、突触膜、神经元间突触、远端轴突、通道活性、GTPase调节活性、神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路和GABA能突触。2.8 基于网络毒理学与多转录组数据综合TPHP诱导ASD毒性分子机制：网络毒理学、GSE28521和E15小鼠前脑转录组数据交集得到1条重叠KEGG通路，即GABA能突触，提示GAD1经该通路在TPHP诱导ASD中发挥关键作用。2.9 核心靶点单细胞测序分析：对GSE203201进行质控、选取1500个高变基因、UMAP聚类并注释为神经上皮细胞、神经元和iPS细胞，GAD1呈细胞类型特异性表达，在神经元中主要表达且显著上调，在神经上皮细胞和iPS细胞中下调，提示TPHP可能通过GAD1靶点激活关键神经元，促进ASD发生发展。2.10 核心靶点GAD1虚拟敲除及基因富集：使用scTenifoldKnk模拟敲除GAD1，受影响最显著的基因包括STMN2、RTN1、LINC01551、INA、FTL、MLLT11、KIF5C、PCSK1N、SCG3和DCX；GO获得104个条目，KEGG获得1条通路，涉及突触组织、轴突发生、轴突发育、神经元胞体、远端轴突、生长锥、微管蛋白结合、酶抑制剂活性、内肽酶抑制剂活性和胆固醇代谢，提示GAD1敲除影响神经元结构发育及脑胆固醇代谢稳态。2.11 TPHP与GAD1蛋白分子对接：AutoDockTools分析显示结合能为?7.9 kcal/mol，优于?5.0 kcal/mol，提示TPHP与GAD1具有良好结合活性。2.12 TPHP–GAD1复合物分子动力学模拟：100 ns模拟中，复合物平均RMSD为0.21 ± 0.02 nm，GAD1为0.15 ± 0.02 nm，TPHP为0.15 ± 0.03 nm，均低于0.3 nm不稳定阈值；平均RMSF为0.11 ± 0.06 nm；氢键数0–2，平均0.27 ± 0.46；平均Rg为2.87 ± 0.01 nm；平均SASA为359.19 ± 4.39 nm²；FEL显示稳定构象；MM-PBSA显示总结合自由能为?23.98 ± 1.20 kcal/mol，其中ΔVDWAALS为?41.20 ± 0.69 kcal/mol、ΔEelec为?8.23 ± 0.28 kcal/mol、ΔEsurf为?5.27 ± 0.03 kcal/mol、ΔEGB为30.73 ± 0.94 kcal/mol、ΔGgas为?49.43 ± 0.74 kcal/mol、ΔGsolvation为25.45 ± 0.94 kcal/mol，提示TPHP与GAD1稳定强结合。2.13 构建TPHP诱导ASD的AOP：整合上述结果构建AOP，TPHP改变GAD1表达和活性，调节GABA能突触信号，导致脑内兴奋-抑制失衡，产生神经发育毒性并诱导加重ASD；依据OECD手册评估生物合理性和证据支持，并从PubMed和Web of Science检索高置信证据。2.14 基于批量分子对接识别芳基OPFRs神经发育毒性风险：85种OPFRs与GAD1批量对接显示，结合最强的前五位为T4NPPP、DP4PPP、B24DTBPPTDP、BDP和PBDMPP，结合能分别为?10.1、?9.2、?9.1、?8.9和?8.9 kcal/mol，均属于含苯环取代基的芳基OPFRs，提示芳基OPFRs对GAD1具有更强结合能力，可能诱导神经发育毒性。

讨论部分指出，OPFRs作为BFRs替代品已成为室内环境主要阻燃剂，并逐渐被认识为内分泌干扰化学物（EDCs），TPHP在多种环境介质和人体样本中高频检出，且暴露可诱导不良神经发育结局。ASD虽具显著遗传病因，但环境因素可增加易感性，约40–50%病因可归因于环境因素。额叶皮层参与情绪、决策和社会认知，其异常与ASD相关，因此研究人员聚焦TPHP在额叶皮层中的毒理效应。传统动物模型成本高、耗时长且存在伦理挑战，计算毒理学具有高效、低成本、高通量和伦理优势。GAD1与ASD病理生理相关，是GABA合成限速酶GAD1（67 kDa）和GAD2（65 kDa）之一，GABA是中枢神经系统主要抑制性神经递质，维持兴奋-抑制平衡；GAD1异常可削弱GABA能抑制信号，破坏E/I平衡，引起神经元网络过度兴奋，并可能间接触发微胶质细胞异常激活和神经炎症，进一步加重兴奋-抑制失衡。芳基OPFRs的神经发育毒性已有研究支持，流行病学提示产前OPFR暴露与子代不良神经发育相关，动物实验显示其具有性别特异性和长期效应。研究局限在于机制主要来自公共转录组数据的计算分析，体内外数据有限，仍需实验验证；其他介质或辅因子值得研究；预测分子相互作用与实际人体暴露的对应关系尚不确定，未来需结合毒代动力学、生物监测和剂量-反应分析。结论翻译为：TPHP是一种神经毒物，具有高吸收、抗代谢和抗排泄以及穿过血脑屏障的能力。在TPHP暴露下，额叶皮层组织中GAD1表达显著下调，激活GABA能突触信号通路，导致脑兴奋与抑制失衡，产生神经发育毒性，并诱导和加重ASD的发生与进展。在OPFRs的神经发育毒性评估中，应优先考虑芳基OPFRs，并在后续OPFRs神经发育毒性研究中予以重点关注。