缬草根中单体化合物的生物活性谱系初探：新型环烯醚萜与缬草烯酸衍生物的分离及神经保护、抗血小板与TRPV1调控作用研究

《International Journal of Molecular Sciences》：A First Insight into the Biological Activity Profile of Individual Compounds of Valeriana officinalis L.

　　

缬草（Valeriana officinalis L.）是欧亚植物区系中分布广泛的代表物种。基于缬草提取物的制剂被传统医学和现代医学认定为镇静剂、抗抑郁剂和抗焦虑剂。尽管人们对缬草提取物的生物学和药理学性质具有极高的兴趣，但其生物活性物质的组成及各组分的具体活性仍未完全阐明。因此，本研究重点关注缬草植株的代谢谱，特别聚焦于其根部具有显著神经保护活性的主要成分。对缬草根的植物化学分析分离得到9种化合物，包括两种此前未描述的环烯醚萜——isovaltrate isovaleroyloxyisohydrin（1）和isovaltrate α-(isovaleroxy)isovaleroxyhydrin（2）——以及一种此前未描述的缬草烯酸衍生物——2-氧代缬草烯酸（2-oxovalerenic acid，3）。此外还分离得到三种已知环烯醚萜——iridoidvol A（4）、isovaltrate isovaleroyloxyhydrin（5）和valtrate hydrine B1（6）——以及缬草烯酸（7）及其代谢物羟基缬草烯酸（8）和乙酰氧基缬草烯酸（9）。对分离所得化合物进行的功能测定显示，所有化合物均具有中等程度的抗氧化活性。此外，化合物3（以及程度较低的化合物8）表现出显著的神经保护潜力，该潜力体现于Aβ25–35诱导细胞毒性模型中的初步抗神经退行性效应。在凝血酶诱导的血小板聚集方面，化合物1、4和7表现出显著的抑制活性，而化合物2、5和6则表现出明显的增强活性。缬草烯酸对TRPV1离子通道具有活性，表现为在表达TRPV1的CHO细胞中既能激活通道，又能增强辣椒素反应。所有化合物均具有中等程度的抗氧化活性。

一、研究背景与科学问题

缬草（Valeriana officinalis L.）作为欧亚大陆广泛分布的多年生被子植物，隶属于忍冬科（Caprifoliaceae），在传统医学和现代医学中均具有悠久的应用历史。早在古希腊医学著作及中世纪欧洲文献中，缬草的安眠和镇静特性已有记载。现代医学实践中，缬草根酊剂和提取物被广泛用作安眠药和镇静剂，且已被纳入俄罗斯、白俄罗斯、哈萨克斯坦、日本、欧洲及美国等多国药典。尽管缬草提取物的生物学和药理学性质备受关注，但其生物活性物质的完整组成及各组分的特异性活性仍未完全阐明。缬草根的主要次生代谢产物包括缬草三酯类（valepotriates）——一组非糖苷型缬草属环烯醚萜，以缬草素（valtrate）、异缬草素（isovaltrate）、高缬草素（homovaltrate）和二氢缬草素（dihydrovaltrate）为主；以及缬草烯酸类衍生物——缬草烯酸、羟基缬草烯酸和乙酰氧基缬草烯酸，这些化合物已被证实是γ-氨基丁酸A型（GABA_A）受体的亚基特异性调节剂。此外，缬草根提取物中还含有酚类化合物（如绿原酸、咖啡酸、没食子酸、香豆酸）和黄酮类化合物（如槲皮素和山柰酚衍生物），以及吡啶生物碱和挥发性精油。鉴于缬草制剂的规模化生产和应用对循证医学方法学提出了更高要求，系统研究其各单体成分的活性谱、作用机制及潜在副作用显得尤为必要。本研究旨在对缬草根中的主要次生代谢产物进行分离鉴定，并综合评价其抗氧化、神经保护和抗血小板活性，为评估各组分对缬草提取物整体药效的贡献提供基础数据。

二、研究内容与主要结论

研究人员对缬草根总乙醇提取物进行了系统的植物化学分析，通过二氯甲烷萃取、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离，共获得9种主要化合物，纯度均达90%以上。其中3种为先前未描述的天然产物：两种新型环烯醚萜——isovaltrate isovaleroyloxyisohydrin（1）和isovaltrate α-(isovaleroxy)isovaleroxyhydrin（2），以及一种新型缬草烯酸衍生物——2-氧代缬草烯酸（3）。其余6种为已知化合物，包括iridoidvol A（4）、isovaltrate isovaleroyloxyhydrin（5）、valtrate hydrine B1（6）、缬草烯酸（7）、羟基缬草烯酸（8）和乙酰氧基缬草烯酸（9）。结构鉴定依托一维和二维核磁共振（NMR）波谱及高分辨串联质谱（HR-MS/MS）数据。功能学评价显示：所有化合物均表现出中等程度的抗氧化活性，但均未超过阳性对照抗坏血酸活性的17%；化合物3在Aβ_25–35诱导的SH-SY5Y分化细胞毒性模型中表现出显著且广浓度范围（0.5–10 μmol/L）的神经保护效应，且未显示毒性；在凝血酶诱导的血小板αIIbβ3整合素活化模型中，化合物1、4和7表现出显著的抑制活性，化合物2、5和6则表现出显著的增强活性，其中化合物6在90 μmol/L浓度下增强效应达1785.4%；缬草烯酸（7）对TRPV1离子通道具有调节活性，既能增强辣椒素和2APB诱导的通道反应，又表现出随后的通道活性下降。上述发现表明，缬草根中不同单体化合物对血小板功能具有双向调节作用，且2-氧代缬草烯酸的神经保护作用可能不依赖抗氧化机制，而涉及特定的受体或神经递质系统。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：反相高效液相色谱-紫外检测（RP-HPLC-UV）用于总提取物的代谢谱初步分析和制备型分离；Sephadex LH-20凝胶柱色谱用于二氯甲烷组分的初步分级；一维和二维核磁共振波谱（¹H NMR、¹³C NMR、COSY、HMBC、DEPT）用于新化合物结构解析；高分辨超高效液相色谱-串联质谱（HR-UHPLC-MS/MS）用于结构确认；2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除实验用于抗氧化活性评价；Aβ_25–35诱导的SH-SY5Y分化细胞毒性模型用于神经保护活性评价；流式细胞术检测纤维蛋白原-Alexa-647结合用于血小板αIIbβ3整合素活化评价；Fluo-4钙离子荧光成像及膜片钳电生理记录（whole-cell patch-clamp）用于TRPV1离子通道调节活性评价。植物材料为2023年初春采收的缬草根，由俄罗斯Krasnogorskleksreda公司栽培，凭证标本（BFU_2023_VO）存放于康德波罗的海联邦大学生命系统研究所。人血小板实验经俄罗斯科学院谢切诺夫进化生理与生物化学研究所伦理委员会批准。

四、研究结果

2.1 总乙醇提取物的初步植物化学分析：RP-HPLC-UV（254 nm）色谱显示，缬草根总提取物的主要成分是相对非极性的代谢物（在65–85%洗脱剂B区间洗脱，保留时间超过30 min），推测为萜类和环烯醚萜类化合物；较极性的组分（25–50%洗脱剂B，保留时间超过15 min）可能为多酚类化合物（包括酚酸和黄酮）及生物碱，后者仅以痕量存在。

2.2 缬草根中单体化合物的分离：通过二氯甲烷萃取和Sephadex LH-20色谱分离获得8个亚组分，其中亚组分5和6经制备型RP-HPLC进一步分离，分别获得4种和5种纯度超过90%的单体化合物。化合物1（t_R 21.2 min）的HR-ESI-MS给出m/z 525.2653 [M+H]⁺，对应分子式C₂₇H₄₀O₁₀，NMR数据表明其为缬草素水合物（valtrate hydrin）母核，四个羟基分别被三个异戊酸残基和一个乙酸残基酯化，结构确定为(1S,7S,8R,9S)-7-乙酰氧基-1,8,11-三异戊酰氧基缬草素水合物。化合物2（t_R 22.7 min）的分子式为C₃₂H₄₈O₁₂，结构与化合物1相似，但第三个酸残基位于10位羟基，且该残基为α-(异戊酰氧基)异戊酸。化合物3（t_R 48.1 min）的分子式为C₁₅H₂₀O₃，HMBC相关显示酮基位于倍半萜母核的2位，确定为2-氧代缬草烯酸，是首个含酮基的缬草烯酸衍生物。

2.3 抗氧化活性：DPPH实验显示，所有分离化合物的抗氧化活性均呈剂量依赖性（化合物3除外），但以抗坏血酸为阳性对照归一化后，最高活性仅为17%（化合物1、4和6在100 μmol/L浓度下），缬草烯酸衍生物的活性更低（化合物7和8分别仅为3%和2.5%），整体评价为低水平抗氧化活性。

2.4 神经保护活性：在Aβ_25–35诱导的SH-SY5Y分化细胞毒性模型中，化合物3表现出最显著的神经保护效应，在0.5–10 μmol/L广浓度范围内均有效，1–5 μmol/L时细胞活力提升近10%，且未显示毒性并略有刺激效应。化合物2、4和6表现出细胞毒性，化合物8的保护效应未达统计学显著水平，化合物9无显著效应。

2.5 对血小板αIIbβ3整合素活化的影响：化合物1、4和7在30–90 μmol/L全浓度范围内显著抑制凝血酶诱导的血小板活化，最大抑制效应见于30 μmol/L（分别为18.9%、32.4%和29.1%）；化合物8和9呈浓度依赖性抑制，90 μmol/L时抑制率分别为50.2%和85.1%；化合物3无显著影响。相反，化合物2在30 μmol/L时即强烈增强血小板活化（284.6%），化合物5在60和90 μmol/L时增强（235.2%和335.9%）但在30 μmol/L时反而抑制（31.2%），化合物6呈浓度依赖性增强（30、60、90 μmol/L时分别为212.9%、885.7%和1785.4%）。

2.6 对TRPV1离子通道的影响：在表达大鼠TRPV1的CHO细胞中，化合物5和8单独应用（5 μmol/L）引起细胞内钙水平可见但非显著的下降；与激动剂2APB共应用时，仅化合物7引起荧光响应的显著增加。膜片钳实验表明，50 μmol/L化合物7与200 nmol/L辣椒素共应用时，首次应用电流增加，第二次应用电流下降，且化合物从细胞洗脱延迟，提示缬草烯酸部分作为TRPV1离子通道调节剂，通过未知机制发挥负性调控作用。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次从缬草根中分离并鉴定了3种新天然产物，扩展了缬草烯酸衍生物的已知种类。抗氧化与神经保护活性之间缺乏相关性，提示化合物3的神经保护作用可能涉及特定的受体或神经递质系统而非抗氧化机制。缬草烯酸对TRPV1的调节活性与其对GABA_A受体的增效浓度相当，该发现可能解释其先前报道的镇痛作用部分源于TRPV1通道调节。血小板实验揭示了缬草单体化合物对血小板活化的双向调节作用——化合物1、4、7抑制而化合物2、5、6增强——提示总缬草提取物中这些效应可能相互拮抗，但富含化合物2、5、6的制剂可能增加血栓形成风险。结论部分总结：从缬草根中分离得到5种环烯醚萜（含2种新化合物）和4种缬草烯酸衍生物（含1种新化合物）；除化合物3外，所有化合物均显著影响凝血酶诱导的血小板活化，呈现明确的活性分化模式；化合物3在Aβ_25–35毒性模型中表现出初步神经保护效应；缬草烯酸对TRPV1离子通道具有调节活性；所有化合物的抗氧化活性均呈剂量依赖性但水平较低，提示分离化合物的神经保护作用可能具有特异性机制，需进一步研究。这些数据为评估各单体成分对缬草提取物整体药效的贡献提供了循证依据，缬草可作为开发新型抗伤害感受药物和调节凝血过程药物的潜在来源。