ZBTB1通过长链非编码RNA SAP30L-AS1与c-Myc相互作用调控三阴性乳腺癌糖酵解及化疗耐药

《Cancers》：ZBTB1 Regulates Glycolysis and Chemotherapy Resistance Through Interacting with c-Myc in Triple Negative Breast Cancer

背景/目的：研究人员前期研究将ZBTB1鉴定为雌激素受体阳性（ER?）乳腺癌的新型肿瘤抑制因子。此外，癌症基因组图谱（TCGA）数据分析显示，三阴性乳腺癌（TNBC）中ZBTB1的表达水平远低于ER?乳腺癌。三阴性乳腺癌缺乏有效的靶向治疗手段，主要依赖化疗，而化疗耐药仍是重大临床挑战。本研究旨在探讨ZBTB1在TNBC进展和化疗耐药中的作用。方法：研究人员在TNBC和阿霉素耐药TNBC细胞中开展了临床生存分析、体内外功能实验、质谱筛选及机制验证。结果：研究人员发现ZBTB1蛋白在TNBC中表达下调，且该下调与患者较短生存期相关。ZBTB1调控TNBC细胞的糖酵解和化疗耐药。机制上，ZBTB1在MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中与c-Myc相互作用并抑制其转录活性，但在阿霉素耐药细胞（MDA-MB-231/ADR和MDA-MB-453/ADR）中该相互作用缺失。长链非编码RNA（lncRNA）SAP30L-AS1是维持TNBC细胞中ZBTB1–c-Myc相互作用所必需的。SAP30L-AS1在阿霉素耐药细胞中显著耗竭，从而破坏了ZBTB1与c-Myc之间的结合。功能验证表明，SAP30L-AS1以ZBTB1依赖的方式调控TNBC细胞的糖酵解和化疗耐药。结论：综上，研究数据表明ZBTB1在TNBC中发挥关键作用，ZBTB1可能为TNBC治疗提供新策略。

论文解读

一、研究背景与意义

三阴性乳腺癌（TNBC）以缺乏孕激素受体（PR）、雌激素受体（ER）和人表皮生长因子受体2（HER2）扩增为特征，在所有乳腺癌亚型中复发率最高、预后最差，约占乳腺癌病例的15%。由于缺乏靶向治疗手段，TNBC治疗高度依赖化疗。然而，经过初期成功治疗后，TNBC肿瘤频繁获得化疗耐药，复发率居高不下，化疗耐药成为TNBC治疗的一大障碍。

越来越多的证据表明，代谢重编程在癌症中发挥关键作用。肿瘤细胞的代谢改变最早由Otto Warburg发现，他揭示癌细胞即使在氧气充足的情况下也偏好利用糖酵解产生ATP，这一现象被称为Warburg效应。TNBC细胞中观察到呼吸损伤和糖酵解增强，且增强的糖酵解被认为与TNBC化疗耐药相关。关键糖酵解酶包括乳酸脱氢酶A（LDHA）和己糖激酶2（HK2）在TNBC中经常过表达，抑制LDHA可抑制肿瘤生长并克服TNBC的化疗耐药，下调HK2则减弱TNBC细胞增殖和肿瘤生长。

ZBTB1是一种POK/ZBTB蛋白，最初被定义为淋巴发育的决定因素。越来越多的研究表明ZBTB1在复制免疫祖细胞中发挥关键作用。研究人员所在团队首次鉴定了ZBTB1在癌症中的作用，发现ZBTB1在ER?乳腺癌中作为新型肿瘤抑制因子发挥作用，其表达下调预示患者预后不良。TCGA数据分析显示TNBC中ZBTB1表达显著低于ER?乳腺癌，但其精确生物学功能尚待充分阐明。因此，本研究旨在探索ZBTB1在TNBC进展和化疗耐药中的作用。

二、主要技术方法

研究人员综合运用了多种关键技术方法：临床样本免疫组织化学（IHC）染色分析110例TNBC患者肿瘤及癌旁组织；体内外功能实验包括细胞增殖（CCK-8）实验、软琼脂集落形成实验和裸鼠异种移植瘤模型；质谱分析（LC-MS/MS）筛选ZBTB1结合蛋白；免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白相互作用；RNA免疫沉淀（RIP）鉴定ZBTB1结合的长链非编码RNA（lncRNA）；染色质免疫沉淀（ChIP）检测转录因子及共抑制因子在靶基因启动子上的募集；以及糖酵解功能检测包括葡萄糖摄取和乳酸产生测定。细胞系包括MDA-MB-231、MDA-MB-436、BT-549、MDA-MB-453及其对应的阿霉素耐药细胞株MDA-MB-231/ADR和MDA-MB-453/ADR。

三、研究结果

3.1 ZBTB1在TNBC中表达下调

IHC检测显示，与正常乳腺组织相比，ZBTB1蛋白在TNBC中表达降低。更重要的是，ZBTB1下调预示TNBC患者总生存期较短（风险比：1.909；95%置信区间：1.108–3.29）。

3.2 ZBTB1抑制TNBC细胞增殖和肿瘤生长

Western blot检测发现MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中ZBTB1水平显著低于BT-549和MDA-MB-436细胞。ZBTB1过表达显著抑制MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞增殖及锚定非依赖性生长，而ZBTB1沉默则促进BT-549和MDA-MB-436细胞增殖。裸鼠实验中，ZBTB1过表达减少了MDA-MB-231来源肿瘤的生长和重量。

3.3 ZBTB1抑制TNBC细胞糖酵解

ZBTB1过表达显著降低MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的乳酸产生和葡萄糖摄取，同时降低HK2和LDHA两种关键糖酵解酶的蛋白水平。相反，ZBTB1敲低则增加BT-549和MDA-MB-436细胞的乳酸产生和葡萄糖摄取。

3.4 ZBTB1调控TNBC细胞化疗耐药

阿霉素耐药细胞MDA-MB-231/ADR和MDA-MB-453/ADR的IC₅₀值分别比亲本细胞高17.4倍和5.1倍。ZBTB1过表达使耐药细胞对阿霉素敏感性增加，IC₅₀显著下降，同时降低耐药细胞中升高的葡萄糖摄取和乳酸产生。体内实验证实ZBTB1过表达增强了阿霉素对肿瘤生长的抑制效果。

3.5 ZBTB1与c-Myc相互作用并抑制其转录活性

通过LC-MS/MS筛选鉴定出204个候选ZBTB1结合蛋白，其中c-Myc因在TNBC中的关键作用引起关注。内源性Co-IP和反向Co-IP均证实ZBTB1与c-Myc在TNBC细胞中相互作用。ZBTB1过表达抑制c-Myc转录活性，但不影响c-Myc表达水平。ChIP实验显示ZBTB1及其共抑制因子N-CoR和HDAC1可被募集到LDHA和HK2启动子的c-Myc结合区域，ChIP-re-ChIP实验表明ZBTB1和c-Myc共同占据这些启动子。

3.6 SAP30L-AS1介导ZBTB1与c-Myc的物理相互作用

Co-IP实验显示ZBTB1与c-Myc的相互作用在亲本细胞中可检测到，但在耐药细胞中缺失，而ZBTB1表达水平在两类细胞中无差异。RNase A处理可消除ZBTB1与c-Myc的相互作用，表明该相互作用依赖RNA。通过catRAPID预测和RIP验证，鉴定出SAP30L-AS1与ZBTB1结合。SAP30L-AS1在耐药细胞中表达显著降低。SAP30L-AS1重新表达可恢复耐药细胞中ZBTB1与c-Myc的相互作用及ZBTB1/共抑制因子在LDHA和HK2启动子上的募集，而SAP30L-AS1沉默则消除该相互作用。

3.7 SAP30L-AS1通过ZBTB1调控糖酵解和化疗耐药

TCGA数据分析显示SAP30L-AS1在TNBC中显著下调。SAP30L-AS1过表达抑制MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞增殖、葡萄糖摄取和乳酸产生，而ZBTB1敲低则显著削弱这些效应。体内实验中SAP30L-AS1抑制MDA-MB-231来源肿瘤生长。SAP30L-AS1过表达使耐药细胞对阿霉素增敏，ZBTB1敲低可逆转该效应。

四、讨论与结论

讨论部分指出，ZBTB1在TNBC中发挥肿瘤抑制因子作用，但其在胰腺癌中表达上调且预示不良预后，表明ZBTB1的作用具有癌症类型依赖性。ZBTB1通过与c-Myc相互作用并募集共抑制因子N-CoR和HDAC1至糖酵解基因启动子，抑制c-Myc驱动的糖酵解。在耐药细胞中，SAP30L-AS1的缺失导致ZBTB1无法与c-Myc结合，从而增强糖酵解并导致阿霉素耐药。值得注意的是，SAP30L-AS1在前列腺癌中发挥促癌作用，而在TNBC中发挥抑癌作用，同样呈现癌症类型依赖性。研究也指出了局限性：ZBTB1与SAP30L-AS1的直接结合仍需RNA pull-down实验验证，c-Myc过表达的拯救实验以及ZBTB1敲除小鼠模型仍需开展。

研究结论为：ZBTB1通过 interacting with c-Myc 调控TNBC细胞的糖酵解和化疗耐药。lncRNA SAP30L-AS1是维持ZBTB1–c-Myc复合物所必需的，这一调控回路可能参与化疗耐药。SAP30L-AS1/ZBTB1轴可能代表克服TNBC化疗耐药的潜在治疗靶点，尽管其潜在的分子细节仍需充分阐明。