昼夜节律通过多巴胺能信号调控果蝇蘑菇体Pka-C1转录振荡以控制睡眠的机制研究

《Current Biology》：Circadian control of dopaminergic signaling to the mushroom body regulates sleep through rhythmic Pka-C1 transcription in Drosophila

　　

尽管昼夜节律起搏器的研究取得了进展，但其调控睡眠的具体机制仍不完全清楚。研究人员此前已证明，大量基因在蘑菇体（mushroom body, MB）的Kenyon细胞（Kenyon cells, KCs）中呈节律性表达，其中包括编码蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）催化亚基的Pka-C1。PKA-C1在促进日间清醒中发挥关键作用，然而其潜在机制尚不明确。在此，利用一种新开发的体内荧光素酶报告基因，研究人员发现γ叶是节律性Pka-C1表达的主要位点。通过结合计算机模拟分析、CRISPR诱变和染色质免疫沉淀技术，研究人员鉴定了转录因子Onecut是γ-KCs中Pka-C1转录节律的调控因子。此外，遗传性跨突触连接图谱和神经元活性成像揭示，背侧外侧时钟神经元（dorsal lateral clock neurons, LNds）向前内侧原脑（protocerebral anterior medial, PAM）簇中的一组多巴胺能（dopaminergic, DA）神经元（即PAM-γ5）提供抑制性输入，从而节律性地调节其活性。这反过来又通过兴奋性Dop1R信号通路节律性地激活MB γ-KCs。由此产生的γ神经元活性节律通过Onecut驱动Pka-C1转录节律。此外，这些PKA-C1节律增强了神经元活性节律，在转录和神经活性节律之间形成了一个反馈循环，从而促进日间清醒。本研究结果强调了DA在促进清醒方面的保守作用，并为其复杂调控提供了机制性见解。更广泛地说，这项工作为昼夜节律如何转化为神经活动以协调睡眠等复杂行为提供了一个机制框架。

一、研究背景与科学问题

昼夜节律是生物体遵循约24小时周期的内在生物学过程，由内在生物钟调控。从蓝藻到人类，生物钟调节着学习记忆、代谢、运动、认知、睡眠、发育、摄食和求偶等多种日常行为和生理过程。昼夜节律紊乱与抑郁症、睡眠障碍、神经退行性疾病及认知损伤等神经系统疾病密切相关。因此，理解昼夜节律与脑功能之间的相互作用是一个至关重要的研究方向。

果蝇因其丰富的行为库、相对简单的神经系统和强大的遗传工具，成为探索这一联系的理想模型。其生物钟依赖于保守的转录-翻译负反馈环路（transcriptional-translational feedback loop, TTFL）。在成年果蝇脑中，分子时钟存在于约240个神经元和1800个胶质细胞中，构成中枢起搏器。时钟网络包含多个解剖学和分子学上不同的神经元类别，包括背侧神经元簇（DN1a, DN1p, DN2, DN3）、表达色素分散因子（pigment-dispersing factor, PDF）的小型和大腹侧侧神经元（s-LNvs和l-LNvs）、PDF阴性的第5个s-LNv、背外侧神经元（LNds）以及后外侧神经元（LPNs）。

蘑菇体（mushroom body, MB）作为中央信息处理中心，在联想学习、睡眠和状态依赖行为（如摄食）中发挥关键作用。每个半球的MB包含约2000个Kenyon细胞（KCs），其轴突投射形成α/β、α′/β′和γ三个叶，并进一步分为15个解剖学分区。这些分区由不同多巴胺能神经元和MB输出神经元（mushroom body output neurons, MBONs）的支配模式定义。多巴胺能（DA）神经元，包括前内侧原脑（PAM）和后外侧原脑（PPL1）簇，在调节学习和记忆以及睡眠中起关键作用。

研究人员先前已证明，MB中有大量基因在时钟神经元控制下呈节律性表达，其中包括编码蛋白激酶A（PKA）催化亚基的Pka-C1。PKA-C1在MB内通过NF1节律性升高cAMP水平，进而提高细胞内Ca²⁺水平，产生白天达到峰值的MB神经元活性节律，促进日间清醒。然而，时钟神经元如何控制MB神经元，特别是PKA-C1节律表达的精确机制尚不清楚。本研究旨在阐明这一机制，探究时钟神经元如何将时间信息传递给MB，从而调控睡眠。

二、研究内容与主要结论

本研究发现，LNd时钟神经元通过抑制性输入节律性地调控PAM-γ5 DA神经元，后者再通过兴奋性Dop1R1信号节律性地激活MB γ-KCs。γ神经元活性节律通过转录因子Onecut驱动Pka-C1转录节律，而PKA-C1节律又反过来增强神经元活性节律，形成一个转录与神经活性节律之间的正反馈循环，最终促进日间清醒。这一发现揭示了昼夜节律调控睡眠的神经回路，拓展了对时间信息如何整合到神经网络中以塑造日常行为模式的理解。

三、主要关键技术方法

1. 1.
   体内荧光素酶报告系统：研究人员开发了组织特异性体内荧光素酶（luciferase）报告基因，包含Pka-C1启动子、FRT-stop-FRT盒、荧光素酶编码序列和3′UTR，用于在活体单只果蝇中实时记录Pka-C1启动子的时空活性。
2. 2.
   CRISPR/Cas9基因编辑：利用CRISPR/Cas9系统在果蝇生殖系中对Pka-C1启动子中预测的Onecut结合位点附近进行定向诱变，生成携带小片段插入或缺失（indels）的突变体系。
3. 3.
   染色质免疫共沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）：使用抗Onecut抗体对果蝇头部基因组DNA进行ChIP-qPCR，验证Onecut转录因子与Pka-C1启动子的直接结合。
4. 4.
   遗传性跨突触逆向示踪（retro-Tango）：应用基于配体-受体相互作用的retro-Tango系统，绘制时钟神经元与PAM/PPL1多巴胺能神经元亚群之间的功能性突触连接图谱。
5. 5.
   P2X2激活与GCaMP钙成像：通过ATP门控阳离子通道P2X2特异性激活时钟神经元，同时利用GCaMP7s钙指示剂监测PAM-γ5神经元的细胞内钙离子水平变化，评估功能性连接。
6. 6.
   CaLexA钙活性报告系统：利用钙依赖性核导入LexA（CaLexA）技术，在恒定黑暗条件下于六个时间点监测PAM-γ5神经元的细胞内Ca²⁺水平，反映其节律性活动。

四、研究结果

1. 组织特异性体内荧光素酶报告基因揭示MB γ-KCs中Pka-C1的表达模式主要由转录调控决定

通过比较两种报告基因（含p10 3′UTR或Pka-C1 3′UTR）在全MB中的表达，发现两者均呈现双峰节律模式，无显著差异，表明启动子足以驱动节律性表达，3′UTR仅起微调相位的作用。

2. γ神经元是MB中节律性Pka-C1表达的主要来源

利用叶特异性GAL4驱动子，发现α/β神经元中Pka-C1-luc信号无节律性；α′/β′神经元虽有节律但振幅较低；而γ神经元的生物发光模式与全MB高度一致，节律性指数无显著差异，表明γ神经元是节律性Pka-C1表达的主要贡献者。

3. γ神经元中的Pka-C1节律依赖于生物钟和神经元活性动态

在per⁰突变体中，γ神经元的Pka-C1-luc节律消失。通过TrpA1热敏通道过度激活γ神经元也破坏了Pka-C1节律，证实了神经元活性与Pka-C1转录之间存在反馈相互作用。

4. 转录因子Onecut是γ神经元中Pka-C1转录节律所必需的

通过计算机筛选和RNAi敲低实验，鉴定出Onecut是候选转录因子。Onecut蛋白在LD和DD条件下均在γ神经元中呈节律性积累，其峰值与Pka-C1-luc节律一致，且在per⁰背景下节律消失。ChIP-qPCR证实Onecut直接结合Pka-C1启动子，且在Onecut结合位点突变体中结合显著减少。

5. CRISPR突变体证实Onecut在调控节律性Pka-C1表达和睡眠中的作用

Pka-C1启动子Onecut结合位点的CRISPR突变体（67.4和69.4）导致日间睡眠增加，并破坏了Pka-C1-luc的节律性。突变体还表现出trans-效应，即内源性启动子突变影响了野生型转基因的节律性，暗示存在反馈回路。

6. LNd时钟神经元通过PAM DA神经元向MB γ叶传递时间信息

retro-Tango示踪显示，LNd和l-LNv时钟神经元是PAM-γ5和PAM-γ3神经元的突触前伙伴。进一步分析表明，CRY阴性的LNd亚型是PAM-γ5的主要突触前伙伴。P2X2激活实验证实，DvPdf阳性神经元（主要为LNds）对PAM-γ5神经元提供抑制性输入。CaLexA实验显示，PAM-γ5神经元在DD条件下呈现双峰钙活性节律，其谷值与LNd活性峰值对应。

7. 来自PAM-γ5神经元的节律性兴奋性输入调控MB γ叶的Pka-C1表达节律和睡眠

在γ神经元中敲低D1样多巴胺受体Dop1R1（而非Dop1R2）显著降低了Pka-C1-luc报告基因的信号强度和节律性，表明PAM-γ5神经元通过Dop1R1介导的兴奋性信号调控γ神经元中的Pka-C1表达。

五、讨论与结论

本研究建立了一条间接通路——LNd-PAM-γ5-MB γ叶回路，通过该通路，昼夜节律起搏器神经元促进日间清醒。PAM DA神经元的激活会升高MB γ4/γ5分区的cAMP和钙信号，PAM-γ5神经元和MB γ5亚区通过Dop1R1信号促进清醒。这种兴奋性多巴胺能通路受昼夜节律控制，LNds对PAM-γ5神经元的抑制作为一种机制，在休息期抑制觉醒信号。LNds至少包含三种分子亚型，其中sNPF和NPF可能通过Gi/o偶联受体介导对PAM-γ5的抑制作用。PAM-γ5神经元的双峰活性提示LNd输入并非其唯一调控因素，其他时钟神经元（如LPNs）可能通过AstC信号间接调节PAM-γ5活性。

Pka-C1在γ-KCs中的双峰转录节律类似于果蝇运动活动的逆模式，但运动活动并非睡眠的直接逆指标。根据睡眠调节的双过程模型，本研究结果提示γ-KCs中的Pka-C1节律通过促进清醒并抵消稳态睡眠压力的累积，构成了昼夜节律清醒驱力的一部分。此外，PKA信号在MB中对记忆和联想学习至关重要，γ叶参与记忆获取和短期记忆形成，而Dop1R1与记忆形成相关，Dop1R2则与主动遗忘有关。因此，Pka-C1转录节律和睡眠调节对Dop1R1的依赖性指向了一个共享通路，该通路可能作为睡眠和记忆形成之间的分子接口。

研究结论翻译：本研究揭示了一条连接昼夜节律输入至MB的通路，整合了分子和神经机制以调控复杂行为。它强调了昼夜节律系统与调控睡眠和觉醒的神经回路之间复杂的相互作用。我们的发现不仅推进了对节律性基因表达和神经元活性背后机制的理解，也强调了昼夜节律调控在塑造复杂的、状态依赖的行为中的更广泛意义。