MTAP缺失通过DNA去甲基化上调BCAT1驱动胰腺导管腺癌支链氨基酸依赖

《Cell Reports》：MTAP loss upregulates BCAT1 in pancreatic cancer and drives branched-chain amino acid dependency

甲基硫代腺苷磷酸化酶（MTAP）缺陷在胰腺导管腺癌（PDAC）中普遍存在。本研究揭示，PDAC中的MTAP缺失通过DNA去甲基化上调支链氨基酸转氨酶1（BCAT1）表达，从而诱导支链氨基酸（BCAA）依赖。研究人员证实，BCAT1上调通过消耗BCAA为三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化（OXPHOS）供能，促进PDAC细胞增殖和迁移。此外，BCAA依赖通过激活癌症相关通路促进更具侵袭性的表型。另外，BCAT1抑制剂BAY-069通过削弱BCAA促进的OXPHOS，在MTAP缺陷PDAC中表现出显著治疗疗效。最后，临床分析揭示PDAC中MTAP与BCAT1表达呈负相关，且高BCAT1表达与PDAC患者不良预后相关。总之，这些发现确定BCAT1作为介导MTAP缺陷PDAC代谢重编程的关键调节因子的作用，并支持BCAT1作为潜在治疗靶点。

研究背景：胰腺癌发病率上升，是全球癌症相关死亡的主要原因之一。细胞毒药物化疗疗效有限且免疫治疗抵抗，不可切除胰腺癌尤其晚期或复发病例仍是肿瘤学难题。近3年靶向KRAS^G12C突变的抑制剂在KRAS^G12C突变胰腺癌中显示疗效，提示基于个体化基因组图谱的治疗策略对标准治疗反应差的患者至关重要。MTAP（甲基硫代腺苷磷酸化酶，参与嘌呤和甲硫氨酸补救途径的关键代谢酶）在约20%–30%的PDAC中因MTAP基因纯合缺失而缺陷，并与不良预后和常规治疗抵抗相关。MTAP缺失不仅影响嘌呤和甲硫氨酸代谢，还重编程多条代谢途径：多胺水平升高激活鸟氨酸脱羧酶（ODC），产生过量腐胺刺激肿瘤细胞生长和迁移；上调RIO激酶1并稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）增强糖酵解；通过异常甲硫氨酸代谢抑制CD8⁺ T细胞浸润，导致骨肉瘤免疫治疗抵抗。因此，基于MTAP缺陷肿瘤重编程代谢谱的新型治疗策略亟待开发。研究人员前期聚焦MTAP缺陷癌症个体化治疗，利用蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）失活提高抗癌疗效。在MTAP缺陷PDAC代谢组学研究中，研究人员发现MTAP缺失增强BCAA（支链氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）分解代谢。BCAA分解第一步由BCAT1和BCAT2催化转氨，生成相应α-酮酸，后者进入TCA循环和OXPHOS促进肿瘤生长。BCAT抑制剂处于临床前研究，但最可能获益的癌种尚不明确。因此，研究人员探究MTAP缺失是否通过DNA去甲基化上调BCAT1，增强BCAA代谢，并评估BCAT1抑制治疗MTAP缺陷PDAC及二者合成致死关系。

技术方法：研究人员用CRISPR构建MTAP敲除（MTAP-KO）胰腺癌细胞系并建立MTAP恢复细胞；采用代谢组学和靶向质谱分析BCAA及其衍生物；RNA测序和蛋白质组学筛选差异基因和蛋白；RT-qPCR和免疫印迹验证表达；甲基化特异性PCR和亚硫酸氢盐测序分析BCAT1启动子DNA甲基化；Seahorse耗氧率、ATP检测和NAD⁺/NADH测定评估OXPHOS；CCK-8（细胞计数试剂盒8）、克隆形成、Transwell和流式细胞术评估增殖、生长、迁移和凋亡；皮下异种移植模型评估体内肿瘤生长及BAY-069疗效。临床样本为90例接受手术切除并辅助化疗的PDAC患者组织芯片，来自上海Outdo Biotech Company；同时分析TCGA、cBioPortal和CellMinerCDB数据。细胞系JF-305由Prof. Jing Gao提供。

研究结果：
1. MTAP缺陷重编程胰腺癌代谢谱并促进BCAA代谢。通过CRISPR构建MTAP-KO细胞，发现MTAP敲除促进PDAC细胞增殖，恢复MTAP表达则抑制增殖、生长和迁移。皮下异种移植显示MTAP缺陷肿瘤加速生长，组织形态更具恶性特征，包括胞核增大、胞质丰满和燕麦细胞样形态。代谢组学显示两组代谢谱显著不同，MTAP缺失激活糖酵解、OXPHOS、柠檬酸循环和BCAA代谢等能量通路；缬氨酸降低而其转氨产物α-酮异戊酸（KIV）升高，TCA中间体琥珀酸和苹果酸增加，腺苷向ATP转化增强，Seahorse证实线粒体呼吸和ATP产生增加，MTAP-KO JF-305对电子传递链（ETC）抑制剂鱼藤酮更敏感。结论为MTAP缺陷重编程PDAC代谢并促进BCAA代谢。

2. MTAP缺陷通过DNA去甲基化上调BCAT1表达促进BCAA分解和ATP产生。RNA测序和蛋白质组学发现BCAT1是介导BCAA转氨增强的关键候选，BCAT1在BCAA分解通路显著富集且mRNA和蛋白水平升高；恢复MTAP后BCAT1下调，BCAT2无显著变化。BCAT1启动子两个CpG岛在MTAP缺陷细胞中低甲基化，恢复MTAP使甲基化由2.9升至10.1倍，MTAP敲除则降低该区域甲基化；DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂地西他滨上调BCAT1。PRMT5敲低不引起BCAT1上调，过表达PRMT5不降低BCAT1，也不改变BCAA丰度，表明该过程独立于PRMT5失活。BCAT1过表达激活BCAA代谢并加速ATP产生，敲低BCAT1减弱线粒体呼吸和ATP产生；MTAP-KO细胞对BCAA剥夺更敏感。结论为MTAP缺失通过启动子DNA去甲基化上调BCAT1，促进BCAA分解和ATP产生，并增强BCAA依赖。

3. BCAT1抑制是MTAP缺陷PDAC的有前景治疗策略。敲低BCAT1抑制细胞增殖、生长和迁移，过表达BCAT1则加速这些过程。RNA测序显示敲低BCAT1改变900余个基因，富集E2F、mTORC1、MYC和细胞周期通路，OXPHOS为最显著代谢通路；蛋白质组学显示代谢通路最富集，30余个能量代谢酶和调节因子改变。在MTAP正常和KO细胞中敲低BCAT1，MTAP-KO组增殖和生长抑制更显著；皮下移植中敲低BCAT1抑制肿瘤生长，尤其MTAP-KO组，免疫组化（IHC）显示Ki67降低。BAY-069和BCATc Inhibitor 2对MTAP-KO细胞抑制更强，BCAT2抑制剂BCAT-IN-2无差异。BAY-069低剂量抑制生长，中剂量增加凋亡并抑制克隆形成，体内50 mg/kg抑制MTAP-KO肿瘤且无体重下降或药物致死。结论为BCAT1抑制对MTAP缺陷PDAC具有治疗潜力。

4. BAY-069抑制MTAP缺失刺激的、BCAT1介导的MTAP缺陷PDAC代谢重塑。PANC-1细胞经BAY-069处理后，代谢组学显示1292种代谢物显著改变，碳代谢、OXPHOS和氨基酸生物合成富集；ATP及TCA中间体富马酸、苹果酸和乙酰辅酶A降低。Seahorse显示BAY-069对MTAP-KO细胞氧化呼吸链和ATP产生的抑制更明显，NAD⁺/NADH比值增加，ATP抑制呈剂量依赖。RNA测序显示BAY-069诱导MTAP正常细胞3512个差异表达基因、MTAP-KO细胞1642个差异表达基因，其中747个重叠；BCAA代谢和OXPHOS相关基因仅在MTAP-KO组富集。结论为BAY-069阻断MTAP缺失刺激的BCAT1介导代谢重编程。

5. MTAP和BCAT1在胰腺癌中的表达及其临床意义。TCGA数据显示，与癌旁组织相比，肿瘤组织中MTAP表达中等升高，BCAT1表达显著降低；CellMinerCDB显示MTAP缺陷与BCAT1 DNA甲基化降低显著相关；MTAP缺失肿瘤患者生存率显著低于MTAP正常肿瘤患者，高BCAT1表达与PDAC不良生存相关。90例接受手术和辅助化疗的PDAC组织IHC显示，BCAT1在肿瘤中低于癌旁，MTAP在肿瘤与癌旁间无显著差异；肿瘤内MTAP和BCAT1表达均与肿瘤淋巴结转移（TNM）分期无关，BCAT1与MTAP表达呈负相关。全部患者5年总生存（OS）率为10.6%，中位OS为21.8个月；BCAT1低表达者5年OS优于高表达者（14% vs 3.6%，p=0.021），MTAP低表达与高表达组无显著差异（7.7% vs 11.1%，p=0.833）。结论为BCAT1可能作为潜在预后生物标志物。

讨论部分总结：靶向癌症代谢日益成为胰腺癌管理的重要策略，尤其对不可切除或转移性肿瘤。MTAP缺陷癌症中阻断嘌呤补救途径可通过抑制其他代谢或调节蛋白提供合成致死机会，MAT2A、PRMT5和ODC等已在MTAP缺陷癌症中显示合成致死。本研究建立BCAA分解代谢在MTAP缺陷PDAC中增强并主要由BCAT1上调驱动，靶向BCAT1可利用两种酶联合功能障碍产生的合成致死，成为治疗MTAP缺陷PDAC的有前景策略。BCAT1上调使BCAA分解产生TCA中间体乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，促进线粒体呼吸和ATP产生；与线粒体BCAT2不同，BCAT1上调增加胞质支链α-酮酸（BCKAs）池，BCKA作为信号分子激活GTPase RhoC，促进细胞生长和迁移。MTAP缺失重塑DNA甲基化景观，本研究发现BCAT1启动子DNA去甲基化介导其上调，可能由MTA积累导致多个表观遗传酶失活，但机制仍需研究。BCAT1和BCAT2功能相似但癌症生物学意义不同：BCAT2普遍表达，BCAT1组织特异且可被应激诱导；例如缺氧诱导胶质母细胞瘤BCAT1表达，肺癌经表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗后BCAT1上调并促进耐药；胰腺癌中BCAT2高表达与恶性表型相关，而BCAT1被认为在基质细胞中产生和释放BCKA进入微环境促进肿瘤生长。本研究表明MTAP缺失可在PDAC肿瘤中诱导BCAT1表达，增强能量产生，BCAT1作为可诱导代谢调节因子。靶向BCAT家族或BCAA代谢是治疗策略，但敏感基因型尚不明确；本研究发现MTAP缺陷PDAC尤其适合BCAT1抑制。BCAT1调节α-酮戊二酸（α-KG）水平，影响α-KG依赖性双加氧酶包括TET家族酶，后者催化DNA和组蛋白去甲基化；BCAT1抑制可干扰MTAP缺陷细胞的转录调控。BCAT1高表达与不良临床结局相关。研究局限包括缺乏MTAP缺失诱导BCAT1位点DNA去甲基化的机制认识，以及缺乏BCAT1抑制临床证据，尚无FDA批准的BCAT1抑制剂，临床可行性和疗效仍需临床试验验证。

研究结论翻译：总之，研究人员揭示MTAP缺陷在胰腺癌中诱导由BCAT1上调介导的BCAA代谢重编程，并提出通过BCAT1抑制治疗MTAP缺陷肿瘤的有前景策略。