《Life》：Strategies for Selecting Reliable Reference-Gene Combinations Across 2D and 3D Cell Culture Models
编辑推荐：
在动态2D/3D细胞模型中，可靠的RT-qPCR归一化不仅需要识别表达变异性低的基因。在本研究中，研究人员评估了在相应2D和3D条件下培养的AML12肝细胞和3T3-L1脂肪细胞中的11个候选参考基因，以确定传统稳定性评估是否足以选择可靠的归一化组合。所有候选
在动态2D/3D细胞模型中，可靠的RT-qPCR归一化不仅需要识别表达变异性低的基因。在本研究中，研究人员评估了在相应2D和3D条件下培养的AML12肝细胞和3T3-L1脂肪细胞中的11个候选参考基因，以确定传统稳定性评估是否足以选择可靠的归一化组合。所有候选基因在AML12细胞中均通过初始筛选，而Actb、18S和Gapdh在3T3-L1细胞中未通过一项或多项预设稳定性标准。geNorm配对变异表明，两个基因归一化在两个模型中均足够（V2/3 < 0.15）。然而，线性混合效应分析（LMM）显示，培养条件对AML12细胞中11个候选基因中的9个以及3T3-L1细胞中全部11个候选基因具有显著影响。使用主成分分析（PCA）、层次聚类和基于BestKeeper的相关性进一步分析表明，高表达稳定性和强参考基因间一致性可与条件依赖性协同变化及与生物学调控靶基因的关联并存。因此，一些算法排名最高的配对在表达独立性方面并未表现出最有利的特征，而归一化因子的选择影响了靶基因响应的幅度和统计学解释。基于这些发现，研究人员提出了一种多步骤、模型特异性策略，将表达稳定性、参考基因间一致性、表达冗余性、条件依赖性和生物学独立性视为不同特征。该方法将重点从选择“最稳定”的基因转向对参考基因组合本身及其对生物学解释影响的实验验证。
一、研究背景、问题与意义
逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）仍是定量基因表达分析的常用方法，但其相对定量的可靠性不仅取决于RNA质量、逆转录效率和扩增性能，还关键取决于数据归一化（normalization）策略。即使数字PCR（dPCR）可绕过Cq值和标准曲线直接定量目标分子，RNA提取和逆转录等分析前变异仍然存在，因此比较生物样本时仍需合适的归一化策略。更新后的MIQE 2.0指南强调，参考基因的选择和数量均应经过实验证明，并在特定生物系统和实验条件下证明其稳定性。传统将基因归类为“管家基因”（HKG）并不能保证其适用于RT-qPCR归一化；任何潜在内参均应先视为候选参考基因，并在特定实验设计中证明适用性。Gapdh、Actb和18S rRNA分别代表常用内参潜在不稳定的不同生物学来源，其表现随实验背景变化。常用稳定性算法评估表达稳定性的不同且部分互补的方面，其排名不必然等同于归一化性能。目前没有单一算法能独立满足复杂生物学实验中对可靠内参的全部实际要求。低Cq变异性本身不足够；合适参考基因应表达变异有限、不系统依赖实验设计主要因素，并尽可能独立于靶基因所反映的生物学过程。使用多个内参时，还应考虑归一化面板成员之间的功能和表达依赖性。Chervoneva等表明候选参考基因间独立性不能假定，最优归一化集合不必然由简单组合个体最高排名基因获得；不同可接受参考基因的选择还可改变靶基因响应幅度及统计学显著性检测。在当代体外模型中，分化、2D与3D组织转换、细胞外基质组成以及细胞黏附和机械信号变化可同时重塑细胞骨架、能量代谢、核糖体生成和转录活动，许多传统参考基因直接或间接参与这些过程，因此其表达可能对培养结构变化敏感。本研究在AML12和3T3-L1两种小鼠细胞系统中平行评估11个常用候选参考基因在可比2D和3D条件下的表达稳定性，主要目的是确定将传统稳定性算法与培养条件效应、多变量表达模式及与生物学相关靶基因共变异直接评估相结合的多步骤策略，是否可改善可靠归一化对的选择；研究旨在建立并实验评估复杂2D/3D RT-qPCR模型中选择生物学合适内参的实用框架，而非寻找通用管家基因。
二、关键技术方法
研究人员使用AML12（Cytion）和3T3-L1（ATCC）细胞系，在标准组织培养塑料（TC）、2D I型胶原（2D Coll）、3D胶原（3D Coll）和含细胞胶原微球（Sph Coll）四种构型中平行培养，并尽量匹配细胞密度、培养时间和分化阶段。采用RT-qPCR检测11个候选参考基因以及Alb、Hnf4a、Itgb1、Ccn1、Fabp4、Fasn等靶基因。稳定性评价使用NormFinder、geNorm和BestKeeper，并以比较ΔCq法和RefFinder作为补充稳健性分析。统计与多变量分析使用线性混合效应模型（LMM）、Pearson相关、主成分分析（PCA）和层次聚类；最终以不同参考基因组合归一化靶基因，并比较表达幅度和统计学解释。
三、研究结果
3.1 AML12和3T3-L1细胞在不同培养条件下的形态学特征与代谢活性：通过resazurin还原法和明场显微镜，研究人员未发现AML12或3T3-L1在各培养条件间resazurin荧光显著差异，细胞形态保持且与相应2D和3D培养格式相容，提示后续基因表达差异反映培养依赖的细胞响应，而非代谢活性降低或细胞完整性受损。
3.2 候选参考基因和靶基因的基础表达水平与变异性：候选参考基因在两细胞中表达水平大致可比，AML12平均Cq为13.04–27.65，3T3-L1为12.91–28.12；18S表达最高，Tbp最低。3T3-L1中Cq变异性总体更高，尤其18S和Actb，其标准差（SD）分别约为AML12的5.0倍和3.3倍，B2m和Gapdh次之；18S和Actb的变异性超过3T3-L1中四个靶基因中的三个，仅Fabp4离散度更大。
3.3 经典稳定性算法识别环境依赖性参考基因排名：AML12中所有候选参考基因在NormFinder、geNorm和BestKeeper标准下均通过筛选；3T3-L1中Actb、18S和Gapdh未通过一项或多项标准，Hmbs为边缘候选。Ywhaz在NormFinder中为两细胞最稳定个体基因，geNorm也将其列为最稳定之一；BestKeeper给出部分不同排名。RefFinder和比较ΔCq法支持主要筛选结果，确认3T3-L1中18S、Actb和Gapdh稳定性较低。
3.4 BestKeeper相关分析揭示候选参考基因间协同表达：在AML12中，研究人员用10个候选构建BestKeeper Index，所有纳入参考基因均与指数显著相关，四个靶基因也与指数显著相关。在3T3-L1中，初始8个候选中有5个与指数显著相关；精简为这5个后，所有保留候选与重算指数强相关，但修订指数与靶基因相关性更强，Fabp4和Fasn呈显著负相关，Itgb1和Ccn1正相关增强，提示与BestKeeper Index强一致不必然意味着独立于靶基因表达。
3.5 直接参考基因–靶基因相关性揭示候选特异性关系：Pearson相关显示，AML12中Actb与Alb、Hnf4a，Ppia与Alb、Hnf4a，Ywhaz与Itgb1、Hnf4a等存在强相关；Nono总体共变异最有限。3T3-L1中B2m和Nono与Itgb1、Ccn1正相关，与Fabp4、Fasn负相关；Ppia和Rplp0与Ccn1强正相关；Tbp与四个靶基因相关均较弱。高算法稳定性候选仍可与靶基因存在大幅相关，且强度和方向在参考基因间及两细胞系间差异明显。
3.6 候选参考基因表达的培养条件依赖性：LMM分析显示，AML12中培养条件对11个候选中的9个有显著影响，仅18S和Nono无显著总体效应，Gapdh和Hprt的F值最高。3T3-L1中培养条件对全部11个候选均有显著影响，Actb和18S效应最强。
3.7 确定参考基因的最优数量和组合：geNorm配对变异分析显示，两细胞模型中两个参考基因已足够归一化，初始V
2/3分别为AML12的0.07和3T3-L1的0.09，均低于0.15阈值，后续V
n/V
n+1也均低于该限。不同稳定性方法对最高排名两基因组合仅部分一致，Ywhaz反复出现，但无单一参考基因对在所有方法和两细胞系中一致最优，稳定性排名本身不足以为最终归一化对提供明确依据。
3.8 基于BestKeeper评估参考基因面板独立于靶基因表达：在AML12中，所有测试两基因组合的组成基因均与其BestKeeper Index显著相关，但常规算法高排名不总对应靶基因独立性；Ywhaz与Alb、Hnf4a、Itgb1显著相关，Ywhaz + B2m保留与Hnf4a、Itgb1关联，Rplp0 + Ywhaz类似；Tbp + Nono靶基因独立性最有利。在3T3-L1中，NormFinder和geNorm来源的配对内部一致性最强，但其指数与全部四个靶基因显著相关；BestKeeper来源配对靶基因关联较少。加入Tbp的效果强烈依赖配对，Hprt + Ywhaz + Tbp和Hprt + Nono + Tbp显示出最有利靶关联谱，而Nono + Ywhaz和Ywhaz + Rplp0加Tbp后仍与Itgb1和Ccn1显著正相关；添加第三个参考基因并不统一改善靶基因独立性。
3.9 2D和3D培养条件下参考基因表达谱的多变量组织
3.9.1 候选参考基因谱的主成分分析：PCA显示两细胞中候选参考基因总体Cq谱存在条件依赖组织。AML12中PC1和PC2分别解释61.06%和14.71%方差，样本主要沿PC1分离，所有11个候选在PC1同向载荷，提示整体协同变异，PC2捕捉基因特异性结构。3T3-L1中PC1和PC2分别解释55.96%和28.13%方差，累计84.09%，样本呈明显条件相关结构，候选沿PC1分为相反方向两组。
3.9.2 候选参考基因谱的层次聚类：层次聚类进一步显示细胞系特异性组织。AML12形成两簇，B2m、Gapdh、Rplp0、Nono、Hprt和Tbp为一簇，18S、Actb、Ywhaz、Hmbs和Ppia为另一簇。3T3-L1聚类模式不同于AML12，但重现PCA主要结构，将Gapdh、Hmbs、Hprt和Tbp与18S、Actb、B2m、Nono、Rplp0、Ywhaz和Ppia分开，其中18S和Actb尤其接近。
3.10 归一化依赖的靶基因表达变化和统计学解释：在AML12中，仅靶基因图谱显示胶原基条件下Alb和Hnf4a表达增加，Itgb1无显著变化，Sph Coll中Ccn1选择性降低；用Ywhaz + B2m或Nono + Tbp归一化大体保留这些条件依赖模式，但效应幅度和显著性水平存在差异。在3T3-L1中，仅靶基因数据四个靶基因均显示明显条件依赖变化；用Hprt + Ywhaz和Hprt + Nono归一化大体保留响应方向和总体模式，但幅度和统计显著性仍有差异；向Hprt + Ywhaz加Tbp未进一步改善与仅靶基因图谱的一致性，并引入额外变化。因此，参考基因组合选择影响归一化后靶基因响应的幅度和统计学解释。
四、讨论总结与研究结论翻译
讨论部分指出，研究人员既往在3T3-L1脂肪细胞模型中已强调在细胞和代谢状态显著变化时验证参考基因；本研究设计使各细胞系内实验组在细胞密度、培养时间、培养基组成、胶原批次和脂肪分化阶段方面尽量匹配，以将培养条件作为主要生物变异来源，并按MIQE原则标准化RT-qPCR分析。在此受控设计中，候选参考基因总体稳定性较高，AML12全部11个候选通过预设标准，3T3-L1中8个通过。更严格筛选阈值下，Actb、18S和Gapdh在3T3-L1中再次表现不可靠，且这一结果在不同引物和独立购买细胞系中重现。研究人员强调，合适参考基因除低总体变异外，还应尽可能独立于实验因素，不应系统跟随生物学调控靶基因的条件依赖变化；BestKeeper原始框架可同时评估候选和靶基因，但与现代应用常偏重SD/CV和HKG–Index相关不同。本研究结果表明，高参考基因间一致性和高算法稳定性可不等于靶基因独立性。LMM显示培养条件对AML12中9个、3T3-L1中全部候选有显著影响，说明3D培养不应被视为标准2D模型的技术变异，培养结构和基质背景可系统改变参考基因表达。根据MIQE 2.0，参考基因选择和数量应针对具体模型实验证明。geNorm提示两基因足够，但不同稳定性方法未一致识别同一最优对。通过为每个预选对构建BestKeeper Index并评估其与靶基因面板的关联，研究人员发现高内部一致性不总伴随低靶基因共变异。PCA和层次聚类可在不依赖常规排名的情况下评估组合内基因是否冗余或互补。在AML12中，Tbp + Nono被整合分析认为最平衡；Nono是LMM中仅两个无显著培养条件效应的候选之一，Tbp效应虽显著但幅度中等，二者多变量谱不完全相同，且组合指数与Alb、Hnf4a、Ccn1无显著关联，仅与Itgb1保留显著关联。在3T3-L1中，培养条件影响全部候选，Actb和18S最强；经典geNorm和NormFinder识别Nono + Ywhaz和Ywhaz + Rplp0，但这些基因多变量谱相似并与靶基因共变异。Ywhaz编码14-3-3ζ，在3T3-L1脂肪生成中具有已知作用，研究人员认为这并不取消其参考基因资格，但质疑仅凭高稳定性排名自动纳入最终归一化面板。BestKeeper SD和CV排名识别出的Hprt + Ywhaz和Hprt + Nono连接了层次聚类中两个主要簇及PC1相反位置，其配对特异性BestKeeper Index对靶基因依赖性更有限。最终功能验证显示，通过多步骤验证的参考基因组合归一化后，靶基因表达模式最接近条件性仅靶基因图谱；其他常规稳定归一化因子虽可用，但更大程度改变响应幅度，有时改变统计和生物学解释。加入第三个参考基因未带来额外优势，支持geNorm关于两基因足够的结论。研究人员提出多步骤策略，整合初始稳定性筛选、归一化面板基因数量确定、条件依赖性、表达互补性和生物学独立性，并通过靶基因归一化进行功能验证。研究局限包括仅两种细胞系和定义2D/3D条件，五个生物学重复支持一致比较但更大样本可提高弱关联估计精度，未来需在更多模型和更广靶基因中评估普适性。
研究结论部分翻译：本研究结果表明，在比较2D和3D模型时，主要挑战不是识别稳定参考基因，而是确定哪个已稳定候选组合提供最可靠归一化。AML12细胞中全部11个HKG通过初始筛选，而3T3-L1细胞中仅Actb、18S和Gapdh被排除。在geNorm指出两个参考基因足够后，算法偏好对之间的差异提出了哪一组合实际最适合归一化的问题。本研究通过区分三个不同特征——表达稳定性、参考基因间一致性和生物学独立性——并利用PCA和层次聚类评估已稳定候选之间的表达冗余，扩展了经典稳定性评估。将这些数据与条件依赖性、HKG–靶基因关系以及通过归一化本身进行的最终验证相整合表明，可靠面板不仅应结合稳定且功能不同的基因，还应结合表达非冗余且足够独立的基因。因此，所提出的方法将重点从选择“最稳定”基因转向对参考基因组合本身及其对生物学解释影响的实验验证。
