USP-48通过H2B去泛素化调控胰岛素介导的长寿与线粒体应激反应

《Cell Reports》：USP-48 enables insulin-mediated longevity and modulates the mitochondrial stress response

　　

摘要专业翻译 线粒体抑制素（prohibitin，PHB）复合物对于线粒体稳态至关重要，然而其缺失对寿命产生相反的影响：在野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans）中缩短寿命，但在胰岛素/IGF-1受体（insulin/IGF-1 receptor）daf-2突变体中却延长寿命，后者表现出减弱的线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt）。为鉴定这种差异性应激反应及其在衰老中的作用的调控因子，研究人员开展了首个在C. elegans中的全基因组双RNAi筛选。研究人员鉴定出泛素特异性肽酶USP-48作为UPRmt的调节因子，在胰岛素信号减弱条件下为寿命延长所特需。USP-48影响线粒体结构和功能，并与转录因子DVE-1协同调控UPRmt，且在很大程度上不依赖于应激相关激活转录因子-1（activating transcription factor associated with stress-1，ATFS-1）。组织特异性分析表明，USP-48主要在皮下组织（hypodermis）中为寿命所需，生殖系（germline）贡献较小，而在肌肉和肠道中则为非必需。在机制上，USP-48通过促进组蛋白H2B去泛素化来塑造应激响应性转录，揭示泛素化是代谢依赖性长寿的关键决定因素。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

线粒体功能障碍是衰老的标志性特征之一，与年龄相关的神经退行性疾病和代谢性疾病密切相关。细胞通过激活线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，UPR^mt）这一进化上保守的适应性应激反应通路来促进线粒体恢复。线粒体抑制素（prohibitin，PHB）复合物由PHB-1和PHB-2两种高度保守的蛋白组成，在内线粒体膜上组装成大型环状复合物，对维持线粒体结构和功能至关重要。然而，PHB缺失在C. elegans中产生相反的寿命表型：在野生型动物中缩短寿命，而在多种代谢受损突变体中延长寿命，这一相反的衰老表型在进化上保守。

在C. elegans中，PHB缺失强烈触发UPR^mt并缩短野生型动物的寿命，但在胰岛素/胰岛素样生长因子1（insulin/insulin-like growth factor 1，IGF-1）受体daf-2(e1370)突变体中，寿命显著延长且UPR^mt诱导被减弱。UPR^mt与长寿之间的明确关系尚不清楚。因此，鉴定短寿命（phb-1(RNAi)线虫）与超长寿命daf-2;phb-1(RNAi)动物中UPR^mt的调节因子，有望揭示PHB缺失导致相反寿命表型背后的机制。本研究正是基于这一科学问题展开。

二、研究内容与主要结论

研究人员开展了首个C. elegans全基因组双RNAi筛选，以鉴定PHB缺失在野生型和胰岛素信号缺陷背景下调控UPR^mt的新型遗传互作因子。通过筛选，研究人员鉴定出去泛素化酶USP-48作为UPR^mt的调节因子，该因子在胰岛素信号减弱条件下为寿命延长所特需。研究表明，USP-48影响线粒体结构和功能，并与转录因子DVE-1协同调控UPR^mt，且在很大程度上不依赖于经典的ATFS-1通路。组织特异性分析显示，USP-48主要在皮下组织中为寿命所需，生殖系贡献较小，在肌肉和肠道中为非必需。在机制层面，USP-48通过促进组蛋白H2B去泛素化来塑造应激响应性转录，揭示泛素化是代谢依赖性长寿的关键决定因素。这项研究首次建立了USP-48作为连接营养感知通路、线粒体稳态和染色质水平转录调控的关键调控节点，对理解衰老及年龄相关病理的干预具有重要意义。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：全基因组双RNAi筛选（利用OrthoList RNAi亚文库，在携带hsp-6p::gfp UPR^mt报告基因的野生型和daf-2突变体中进行）；寿命分析（在20°C下进行，使用Log-rank检验进行统计学分析）；荧光报告基因分析（包括UPR^mt报告基因hsp-6p::gfp和hsp-60p::gfp、UPR^ER报告基因hsp-4p::gfp及热休克反应报告基因hsp-16.2p::gfp）；线粒体耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）测量（使用Seahorse XFp分析仪）；共聚焦显微镜成像与线粒体网络形态定量分析；RNA测序（RNA-seq）转录组分析；染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据比较分析；CRISPR-Cas9基因编辑技术（用于生成内源性GFP融合蛋白和FLAG标记品系）；Western blot蛋白水平检测；组织特异性RNAi技术；实时定量PCR（RT-qPCR）。RNA-seq数据已存入SRA数据库（BioProject：PRJNA1370799），DVE-1 ChIP-seq数据来自ENCODE门户（实验：ENCSR694VLW）。

四、研究结果

（一）UPR^mt是daf-2突变体及其PHB缺失后寿命延长所必需的**

研究人员通过RNAi耗竭ATFS-1（UPR^mt的关键激活因子），发现atfs-1 RNAi不影响野生型或phb-1(RNAi)动物的寿命，但抑制了PHB缺失在daf-2突变体中赋予的寿命延长，并大幅缩短了daf-2突变体本身的寿命。这表明ATFS-1介导的UPR^mt对胰岛素/IGF-1信号（IIS）突变体的长寿至关重要。

（二）鉴定出影响野生型和daf-2突变体中UPR^mt的PHB互作因子**

研究人员在PHB缺失的线虫和PHB缺失的daf-2突变体中进行了双RNAi筛选，共鉴定出355个（5.7%）在phb-1(RNAi)线虫中降低UPR^mt的基因和419个（6.8%）在daf-2;phb-1(RNAi)突变体中降低UPR^mt的基因，以及分别有102个（1.7%）和287个（4.6%）基因的缺失增强UPR^mt。通过基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析发现，增强UPR^mt的基因富集于发育和行为过程以及线粒体特异性功能；而抑制UPR^mt的基因富集于蛋白质合成相关通路。经复测验证，7个基因（znf-622、tlf-1、eef-1B.1、skr-1、blmp-1、usp-48和his-65）被确认为UPR^mt调节因子，其中研究人员重点关注两个表观遗传因子HIS-65和USP-48。

（三）泛素特异性肽酶USP-48是胰岛素介导长寿所必需的并调控线粒体稳态

寿命分析显示，usp-48敲低在所有测试条件下均缩短寿命，其中对daf-2突变体（缩短65.5%）和daf-2;phb-1(RNAi)突变体（缩短75.5%）的影响最为显著，表明IIS缺陷动物更依赖于usp-48。usp-48缺失几乎完全消除了daf-2突变体的寿命延长及其PHB缺失赋予的额外寿命延长。在daf-7和isp-1突变体中也观察到类似效应。usp-48突变体在基础条件下表现出升高的UPR^mt，但在daf-2背景下被减弱；usp-48功能缺失加剧了phb-1介导的UPR^mt，并抑制了daf-2突变体特征性的UPR^mt减弱。相比之下，USP-48对UPR^ER和热休克反应（HSR）的影响有限，表明其主要调控线粒体应激反应通路。usp-48突变体表现出更高的基础耗氧率且随年龄增加差异增大，线粒体网络在肌肉和皮下组织中均呈现紊乱状态。RNA-seq分析检测到4,639个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），上调基因富集于应激反应、蛋白水解、代谢和肌肉功能等类别，下调基因富集于转录和翻译过程、DNA修复、发育和代谢等类别。

（四）USP-48与DVE-1互作调控UPR^mt，在很大程度上不依赖ATFS-1

usp-48;dve-1双突变体协同增强UPR^mt激活，而ATFS-1耗竭仅引起最小且不显著的抑制，表明USP-48和DVE-1在一条很大程度上独立于ATFS-1的UPR^mt分支中发挥作用。在usp-48突变体中，DVE-1在皮下组织和肠道细胞核中显著增加。将DVE-1 ChIP-seq数据与usp-48突变体RNA-seq数据比较发现，2,504个上调基因中有644个是DVE-1靶基因，2,135个下调基因中有472个是DVE-1靶基因。与ATFS-1靶基因的重叠则小得多，仅占上调基因的约6%和下调基因的约7%，而DVE-1分别占约26%和约22%。

（五）USP-48以组织特异性方式为寿命所需并在细胞核中积累

组织特异性RNAi实验表明，皮下组织特异性耗竭usp-48显著缩短寿命，生殖系特异性耗竭也缩短寿命但程度较小，而肠道或肌肉特异性耗竭无显著影响。单拷贝整合的hsp-6p::gfp报告基因分析显示，usp-48耗竭在皮下组织和肠道中均显著增加UPR^mt报告基因荧光，皮下组织（1.36倍）强于肠道（1.17倍）。内源性GFP::USP-48融合蛋白分析显示，daf-2突变单独仅在皮下组织中适度增加USP-48核水平；phb-1缺失在野生型和daf-2背景下均增加皮下组织和生殖系中的USP-48水平；而在肠道中，daf-2突变特异性抑制了phb-1缺失诱导的USP-48核积累。usp-48 mRNA仅在daf-2;phb-1(RNAi)动物中增加。SGK-1（TORC2复合物成员）缺失在肠道、生殖系和皮下组织中均显著增加核USP-48水平，但在肠道和生殖系中依赖于DAF-2，在皮下组织中则不依赖。USP-48水平在皮下组织中依赖于DAF-16、SKN-1和PHA-4等多个长寿转录因子。

（六）USP-48通过组蛋白H2B去泛素化参与应激诱导的基因调控

在phb-2突变体中，dot-1.1或zfp-1 RNAi进一步增加hsp-6p::gfp信号；在daf-2突变体中，phb-1与dot-1.1或zfp-1双RNAi也诱导UPR^mt。H2B E3泛素连接酶rfp-1的RNAi在两种基因型中均抑制UPR^mt，而H2A E3泛素连接酶brc-1和spat-3的RNAi增强应激反应。Western blot分析证实，phb-1和usp-48同时耗竭导致H2Bub1水平显著增加。DOT-1.1和ZFP-1靶基因与usp-48突变体上调基因的比较鉴定出297个共同靶基因，其中包含多种线粒体功能相关基因和UPR^mt相关基因（如egl-30），且40%的重叠基因也是DVE-1靶基因。研究人员提出模型：USP-48在应激过程中通过H2B去泛素化促进RNA Pol II暂停，防止应激反应基因过度激活，为线粒体维持程序提供转录控制。

五、讨论与结论

讨论部分指出，PHB家族蛋白在野生型动物中促进寿命但在代谢受损条件下限制寿命，本研究通过全基因组双RNAi筛选成功鉴定了新的保守的胰岛素依赖性PHB介导长寿调节因子。ATFS-1在daf-2突变体寿命延长中的必需性表明，ATFS-1活性的精确平衡而非过度激活对促进长寿至关重要。USP-48在发育期发挥作用以决定成体寿命。USP-48与DVE-1的协同作用提示其可能通过染色质修饰调控UPR^mt。研究人员提出USP-48可能通过与ZFP-1/DOT-1.1复合物合作促进应激反应基因处的RNA Pol II暂停，将去泛素化与胰岛素信号联系起来。同时，研究人员也承认研究中存在的局限性，包括无法排除非组蛋白底物去泛素化的影响、直接靶基因鉴定困难、H2B去泛素化证据为相关性而非直接生化证明，以及研究仅限于C. elegans，USP48在哺乳动物线粒体应激信号中的类似作用仍有待验证。

研究结论：研究人员将USP-48鉴定为线粒体功能和应激响应性长寿的新型调节因子，主要在皮下组织中发挥作用。USP-48为daf-2突变体的寿命延长及其PHB缺失赋予的增强效应所必需，但在正常条件下基本为非必需。在机制上，USP-48与DVE-1协同驱动一条不依赖ATFS-1的UPR^mt通路，并通过H2B去泛素化调控转录。这些发现定义了连接营养感知通路、线粒体稳态和染色质水平转录控制以促进生物体适应性的关键调控节点。