《Pathogens》：Mapping Hepatitis B Virus Research and Genomic Diversity in Latin America and the Caribbean
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弯曲杆菌属（Campylobacter）物种，尤其是空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）和结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli），仍然是全球细菌性食源性胃肠炎的主要病原体，家禽是其主要储存宿主，其他传播途径还涉及
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弯曲杆菌属（Campylobacter）物种，尤其是空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）和结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli），仍然是全球细菌性食源性胃肠炎的主要病原体，家禽是其主要储存宿主，其他传播途径还涉及牲畜、生乳、水源、新鲜农产品以及食品加工环境。准确的检测与定量对于风险评估、过程卫生监测、暴发调查以及“一体化健康”（One Health）监测至关重要；然而，可靠的测量因该微生物微需氧（microaerophilic）的苛养生长需求、应激敏感性、在复杂基质中低水平或不均匀分布，以及进入活菌但不可培养（viable but non-culturable，VBNC）状态的能力而变得复杂。本综述检视了食品生产全链条（包括收获前、收获与加工、收获后与零售，以及消费者层面）中弯曲杆菌检测与定量的现有及新兴方法。将传统培养、菌落计数、最大可能数（most probable number，MPN）方法和免疫学检测与分子方法进行比较，包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、定量PCR（qPCR）、数字PCR（digital PCR）、活性PCR（viability PCR）、全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）、宏基因组学（metagenomics）、生物传感器（biosensors）、微流控（microfluidics）以及人工智能辅助监测。本文还讨论了监管与标准化框架，包括国际标准化组织（International Organization of Standards，ISO）、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）、美国农业部食品安全检验局（United States Department of Agriculture-Food Safety and Inspection Service，USDA-FSIS）以及欧盟（European Union，EU）的过程卫生标准，同时涉及“一体化健康”监测体系。总体而言，未来的弯曲杆菌监测将需要整合的、针对特定基质的策略，将标准化培养计数、基于活性的分子定量、基因组来源归因以及协调统一的元数据相结合，以支持更快速、准确且基于风险的食品安全决策。
论文主体内容学术总结
1. 引言
弯曲杆菌是全球范围内导致人类细菌性胃肠炎的最常见病原体，其中空肠弯曲杆菌（C. jejuni）和结肠弯曲杆菌（C. coli）是与人类疾病最相关的嗜热物种。家禽是主要储存宿主，但生乳、污染水源、新鲜农产品以及动物接触等途径同样构成重要传播风险。仅依赖存在/不存在检测不足以评估公共卫生风险，因为感染概率与摄入的活菌剂量密切相关。欧盟已针对屠宰后冷却的肉鸡胴体建立了弯曲杆菌的过程卫生标准，以每克1000个菌落形成单位（CFU/g）为限值，依据EN ISO 10272-2方法进行计数。定量检测因此成为暴露评估和基于风险的食品安全决策的核心要素。
2. 弯曲杆菌与检测相关的生物学与生态学特征
弯曲杆菌属为革兰氏阴性、弯曲或螺旋形的微需氧细菌，具有非发酵代谢特征，主要依赖氨基酸和三羧酸循环中间产物。嗜热物种在37–42°C下生长最佳，30°C以下基本不生长。该菌在不利环境条件下可进入活菌但不可培养（VBNC）状态，细胞仍具代谢活性但无法在常规培养基上形成菌落。冷暴露、氧化应激和营养限制均可降低可培养性而不一定消除细胞活性。生物膜形成和表面附着进一步增加了检测难度，生物膜内细胞分布不均且更难从采样表面脱落。
3. 食品生产全链条中的来源与传播
3.1. 收获前（农场层面）
家禽尤其是肉鸡是弯曲杆菌的主要储存宿主，盲肠定植通常无症状但载量较高。其他牲畜及农场相关来源包括水源、垫料、灰尘、昆虫和啮齿动物。盲肠和新鲜粪便样本载量高但有机物和竞争菌群多，环境样本则载量低且细胞常处于应激状态。收获前监测应采用分层采样策略，结合ISO 10272-2中涵盖的粪便、灰尘和拭子等样本类型。
3.2. 收获与加工
屠宰过程中，脱羽和掏膛是关键的污染节点，肠道内容物可扩散至胴体皮肤、设备和加工表面。加工过程中的烫洗、冲洗、冷却和消毒虽可降低细菌载量，但也可能损伤存活细胞并抑制可培养性。颈皮取样是过程卫生监测的重要方式，但颈皮计数与全胴体冲洗液计数不可互换。该阶段应采用混合分析策略：培养计数用于法规监测，活性PCR（如PMA-qPCR）用于补充检测应激或受损细胞。
3.3. 收获后与零售
生鲜禽肉仍是主要暴露载体，生乳和新鲜农产品为低频但重要的传播途径。冷藏禽肉中细胞可能受损，FDA BAM建议打开包装后立即分析。生乳污染通常为低水平间歇性，需要增菌处理。新鲜农产品中弯曲杆菌分布不均且受背景菌群干扰。检测应根据产品类型调整，采用培养与活性分子方法相结合的混合方案。
3.4. 消费者层面
消费者层面的传播主要通过未煮熟的禽肉和厨房交叉污染。CDC建议禽肉烹饪至内部温度74°C，生熟分开，处理生禽后彻底清洗砧板、器具和双手，并避免清洗生禽以防止飞溅传播。消费者层面的检测标准化程度较低，通常依赖暴发调查中的剩余食品和厨房表面拭子采样。
4. 弯曲杆菌的传统检测与定量方法
4.1. 基于培养的方法
培养法仍是法规参考方法，ISO 10272-1:2017指导检测，ISO 10272-2:2017规范菌落计数，FDA BAM第7章提供实际操作指南。选择性培养基的发展经历了Skirrow培养基、Preston培养基到无血木炭基培养基（mCCDA）的演变。培养法可回收活菌并支持后续确认、药敏检测和基因组表征，但耗时长（48–72小时以上），且无法检测VBNC细胞。
4.2. 最大可能数（MPN）
MPN方法适用于直接平板计数灵敏度不足的低载量样本，如零售禽肉冲洗液、生乳和环境水样。微型化MPN方法已被开发用于禽肉相关基质。该方法劳动强度大且置信区间宽，仅在直接计数不适用时作为针对性计数策略。
4.3. 免疫学方法
酶联免疫吸附试验（ELISA）和侧向层析检测可快速筛查弯曲杆菌抗原，但无法区分活菌与死菌，灵敏度和特异性受基质影响，阳性结果通常需要培养确认。
5. 分子检测与定量方法
5.1. 常规PCR与多重PCR
常规PCR通常靶向16S或23S rRNA基因及物种特异性基因（如hipO、mapA、glyA、ceuE）。比较评估显示cdtC和hipO对C. jejuni准确性最高。多重PCR可同时检测多个物种，高分辨率熔解（HRM）分析进一步提高了物种区分能力。
5.2. 定量PCR（qPCR）
qPCR可实时监测扩增并定量污染水平。多重qPCR可同时检测多个物种，如靶向hipO（C. jejuni）、glyA（C. coli）和pepT（C. lari）的检测体系。叠氮化丙锭（PMA）-qPCR是应用最广泛的活性知情qPCR策略，PMA可穿透膜受损的死细胞并结合其DNA阻止扩增。
5.3. 数字PCR
数字PCR（dPCR）通过将样本分配至大量独立反应并应用泊松统计实现绝对定量。在肉鸡颈皮样本中，dPCR和qPCR均与ISO平板计数高度相关，dPCR对扩增效率变异和PCR抑制剂具有更高耐受性。PMA-ddPCR在检测活性C. jejuni方面较PMA-qPCR具有更高灵敏度。
5.4. 活性PCR
活性PCR（vPCR）使用PMA、增强型PMA（PMAxx）或溴化乙锭单叠氮化物（EMA）等DNA嵌入染料减少死细胞DNA的扩增。PMAxx基vPCR工作流程已在生乳和水中优化，检测限为4.67×103至9.84×101 CFU/mL。vPCR应被解释为基于膜完整性的估计而非感染性的直接度量。
6. 先进与新兴技术
6.1. 全基因组测序（WGS）
WGS主要用于分离株的详细表征而非常规检测。核心基因组多位点序列分型（cgMLST）和单核苷酸多态性（SNP）分析支持暴发调查、来源归因和耐药谱分析。丹麦的研究表明常规WGS可识别此前未发现的C. jejuni暴发事件。
6.2. 鸟枪法宏基因组测序
鸟枪法宏基因组测序已在禽舍空气样本中检测弯曲杆菌，最低检测浓度为200 CFU/样本，但受DNA提取偏差和分类学注释挑战的影响。
6.3. 生物传感器
生物传感器将抗体、适配体或核酸探针等识别元件与电化学、光学或压电换能器整合，代表新兴的检测平台类别，但多数尚未实现商业化食品检测应用。
6.4. 微流控与芯片实验室
微流控平台将多个分析步骤整合至紧凑的芯片实验室设备。纸基/聚合物混合微流控装置整合了DNA提取、重组酶聚合酶扩增（RPA）和侧向流检测，可在鸡肉样本中检测C. jejuni，检测限为46 CFU/mL。
6.5. 人工智能与机器学习整合
机器学习模型已成功分析数千个弯曲杆菌基因组以识别家禽为主要人类感染来源。基于支持向量机和随机森林的光谱预测方法可实现约76%的平均预测准确率。随机森林模型还被用于预测放牧家禽农场的弯曲杆菌流行率。
7. 食品链中的定量挑战
7.1. 活性与方法学局限
培养法在冷藏链后期会低估真实载量，而qPCR因检测活菌和死菌DNA而常产生更高结果。单轮PMA处理在禽肉基质中常无法完全消除死细胞DNA信号。
7.2. 基质效应与采样基质差异
不同采样方案产生系统性不同的弯曲杆菌分布。配对样本中颈皮计数（2.04 log10 CFU/g）显著高于全胴体冲洗液（1.31 log10 CFU/mL）。靴袜和粪便样本载量是冷却后胴体冲洗液载量的显著预测因子。
7.3. 群体水平与加工阶段变异性
间歇性排菌、异质性定植和加工驱动的交叉污染造成污染模式的空间和时间变异性，使采样方案设计和定量微生物风险评估模型面临挑战。
7.4. 监测场景中的经济考量
在低污染水平（约500–1000 CFU/g）下，qPCR和dPCR的定量性能受限，培养法在需要标准化低水平活菌计数时仍不可替代。
8. 标准化与监管框架
8.1. 弯曲杆菌检测与计数的国际标准方法
ISO 10272系列是食品链检测的主要国际参考框架，2023年修正案纳入了分子确认和鉴定方法。
8.2. 欧盟与美国监管框架
欧盟法规(EU) 2017/1495建立了肉鸡胴体冷却后弯曲杆菌1000 CFU/g的过程卫生标准。美国FDA BAM和USDA-FSIS提供方法指导，但美国未采用等效的可执行定量过程卫生标准。
8.3. “一体化健康”监测与基因组整合
EFSA和ECDC年度报告确认弯曲杆菌病是欧盟最常见的人畜共患病。美国NARMS追踪食品细菌耐药性，CDC PulseNet自2016年起使用WGS进行常规弯曲杆菌监测。ISO 16140-2提供替代方法验证原则。
9. 未来趋势与创新
9.1. 长期技术创新
CRISPR诊断、宏基因组学和AI/ML辅助分析的整合可能实现日益不依赖培养的检测和来源追踪，但需要广泛验证和成本降低。
9.2. 短期可行改进
生物传感器、微流控和便携式分子诊断平台可缩短检测时间并实现近线检测。WGS可增强菌株表征和来源归因。建议建立统一的“一体化健康”元数据框架，涵盖样本/分离株ID、采集日期与地点、来源部门与采样阶段、样本类型、采样与实验室方法，以及分离株/基因组信息。
10. 结论
培养法仍是法规参考方法，但会低估受损、应激或VBNC细胞。qPCR、dPCR和活性PCR提供更快速的检测或定量补充。WGS改善暴发调查和来源归因。未来工作应聚焦于针对标准化参考方法的基质特异性验证，以及整合培养、分子定量和基因组数据的综合工作流程。
