宿主N-糖基化成熟在EPEC感染中的双重作用：N-连接poly-LacNAc介导BFP黏附并促进T3SS效应蛋白转运

《Cell Reports》：Dual roles of host N-glycosylation in enteropathogenic Escherichia coli infection

宿主因子决定病原体嗜性，但促进肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）感染的宿主基因知识有限。为鉴定EPEC感染所需的宿主决定因素，研究人员开展了两个独立的基因组规模CRISPR-Cas9筛选。两者均汇聚于宿主N-糖基化（N-glycosylation）是感染的关键需求。对N-聚糖成熟（N-glycan maturation）的遗传或药理学抑制表明，N-糖基化通过两条不同途径促进感染。第一，N-连接多聚-N-乙酰乳糖胺（N-linked poly-N-acetyllactosamine, poly-LacNAc）聚糖作为EPEC主要黏附素束状菌毛（bundle-forming pilus, BFP）的受体。第二，N-糖基化扰动损害宿主膜结构，导致III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）活性降低，且独立于宿主细胞黏附。利用人结肠和空肠类器官来源的上皮单层，研究人员进一步表明，EPEC黏附与末端甘露糖暴露呈负相关，提示聚糖组成可能参与决定肠道嗜性。总之，这些发现确立宿主N-聚糖成熟是肠道感染期间被利用的关键宿主途径。

研究背景方面，EPEC引起婴儿腹泻，尤其在低中收入国家，可严重甚至致死，并可在暴发和散发中出现。EPEC属于诱导“黏附与消失”（attaching and effacing, AE）病变的病原体，特征为微绒毛消失、细菌紧密黏附和附着细菌下方形成富含肌动蛋白的“基座”（actin pedestals）。其感染包括多个步骤：初期黏附由束状菌毛（bundle-forming pilus, BFP）介导，随后EPEC利用III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）注入效应蛋白（effector proteins），干扰细胞骨架、囊泡运输、信号转导和细胞周期。Tir是首个注入的T3SS效应蛋白，在宿主膜内形成发夹结构并与intimin结合，导致紧密黏附并招募N-WASP和Arp2/3复合物形成肌动蛋白基座。研究人员近期表明，EPEC过表达小RNA（small RNA, sRNA）MgrR（Mg²⁺-responsive RNA）可变得超毒，部分通过抑制CesT实现。许多EPEC-宿主互作仍未知，因此需要鉴定感染所需宿主因子。

研究人员开展了两个独立的全基因组CRISPR-Cas9筛选，分别基于宿主细胞毒性和Tir-intimin相互作用，发现多个宿主途径，包括肌动蛋白细胞骨架、基因表达调控和糖基化。两项筛选均将多聚-N-乙酰乳糖胺（poly-N-acetyllactosamine, poly-LacNAc）糖基化途径列为重要命中，提示该途径是EPEC感染性的关键决定因素。研究表明，LacNAc糖基化既为BFP介导的黏附所需，也为高效T3SS效应蛋白转位所需；人结肠和空肠类器官感染显示，空肠优先黏附与组织表面聚糖相关。该研究强调N-糖基化在EPEC感染中的复杂作用，为抗腹泻病抗毒力策略提供基础。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员开展两个独立全基因组CRISPR-Cas9筛选：毒性筛选使用Avana sgRNA文库转导HT-29细胞，感染超毒EPEC/pMgrR，经四轮富集后测序并以MAGeCK分析；Tir转位筛选使用Brunello文库转导K562细胞，以EPEC Δeae感染，再用表达intimin和GFP的E. coli K12标记表面Tir，经FACS分选高、低GFP群体。随后使用MGAT1敲除HeLa、kifunensine处理、LDH毒性检测、流式细胞术、免疫荧光、split nanoluciferase效应蛋白转位检测、NHS-biotin表面蛋白质组学与LC-MS/MS。人结肠和空肠类器官来源于University Hospital of Würzburg生物样本库，伦理批准37/16，并获得知情同意。

结果部分保留各小标题并浓缩如下。

两个CRISPR筛选鉴定宿主N-糖基化为EPEC感染的核心需求：毒性筛选以EPEC/pMgrR感染Avana文库转导的HT-29细胞，四轮富集后比较gRNA丰度，获得数十个显著富集基因；Tir转位筛选以EPEC Δeae感染Brunello文库转导的K562细胞，用表达intimin和GFP的E. coli K12标记表面Tir，FACS分选低、高GFP群体，低GFP群体富集感染所需基因。两个筛选共同命中B3GNT2，其编码β-1,3-N-乙酰葡糖氨基转移酶，参与poly-LacNAc合成。毒性筛选还命中MGAT1、SLC35A2和TMEM165，后者为高尔基Mn²⁺/Ca²⁺转运体，调节N-糖基化酶所需锰供应。MGAT2和MGAT5也在LacNAc生物合成相关基因中出现。

MGAT1敲除细胞对EPEC毒性抵抗增加：研究人员靶向MGAT1，因其催化N-糖蛋白甘露糖残基添加N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine, GlcNAc），是N-连接poly-LacNAc生成前提。HeLa MGAT1敲除经测序、western blotting和免疫荧光确认。EPEC/pMgrR感染后，野生型HeLa细胞毒性约70%，MGAT1敲除细胞约35%，验证MGAT1贡献EPEC毒性易感性。

MGAT1敲除改变细胞表面聚糖结构：MGAT1缺失预期消除LacNAc并增加末端甘露糖展示。流式细胞术显示MGAT1敲除细胞刀豆蛋白A（concanavalin A, ConA）结合增加，小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）染色减少。1:1混合野生型和敲除细胞后，抗MGAT1和ConA双染显示敲除细胞缺乏核周MGAT1信号且ConA染色显著升高，提示表面聚糖可能参与EPEC感染。

EPEC微菌落对MGAT1敲除细胞黏附减少：1:1混合感染野生型EPEC后，感染1–1.5 h时MGAT1敲除细胞上微菌落黏附减少；2–2.5 h差异减弱。T3SS缺陷株ΔescRSTU仅通过BFP黏附，其黏附在2 h仍低，补回MGAT1后恢复。外源可溶性LacNAc抑制野生型HeLa细胞黏附至类似MGAT1敲除水平，支持表面末端LacNAc是BFP受体。

BFP和I型菌毛对野生型和MGAT1敲除细胞的反向黏附：BFP缺陷株ΔbfpA对MGAT1敲除细胞黏附呈双峰，与I型菌毛（type I fimbriae, T1F）相变相关。PCR显示T1F-ON状态与对MGAT1敲除细胞广泛黏附强相关；补回MGAT1恢复低T1F结合。D-甘露糖显著降低ΔbfpA T1F-ON对MGAT1敲除细胞黏附，对野生型低黏附影响小。结果表明LacNAc缺失暴露甘露糖，使T1F介导补偿性黏附，绕过BFP功能丧失。

MGAT1通过依赖黏附和不依赖黏附机制增强T3SS效应蛋白转位：使用split nanoluciferase检测，MGAT1敲除细胞中EspF和EspG转位减少，与基座形成减少相关。BFP和T1F双缺陷株ΔbfpA Δfim对野生型和敲除细胞黏附相等且低，但敲除细胞仍形成显著更少肌动蛋白基座，EspF转位减少，说明T3SS活性受损独立于细菌结合。MGAT1依赖的N-糖基化通过两种机制支持感染：提供BFP受体增强黏附和后续T3SS转位；独立于黏附进一步增强T3SS活性。

MGAT1缺失广泛重塑宿主细胞表面蛋白质组：N-糖基化对高尔基介导蛋白分选和膜运输关键。NHS-biotin表面标记后质谱显示，MGAT1敲除细胞表面蛋白质组显著改变。细胞黏附与细胞外相互作用、膜域组织、细胞骨架组织相关蛋白强烈减少，包括LGALS3（galectin-3）、ITGA4、ITGA7、ICAM1、MCAM、BCAM和CAVIN1。MGAT1缺失广泛损害宿主膜微域完整性，而EPEC T3SS转位子插入需要该环境。CRISPR筛选命中的ARPC4、SPTBN1和CTNND1膜相关水平也降低。

Kifunensine处理表型模拟MGAT1敲除：kifunensine抑制内质网甘露糖苷酶I（ER mannosidase I, Man1），影响甘露糖修剪和MGAT1活性。处理HeLa和HT-29细胞后ConA染色增加，EPEC黏附显著减少，split nanoluciferase和基座形成显示T3SS活性在依赖和不依赖黏附方式下受抑制。干扰N-聚糖成熟破坏EPEC感染多个阶段。

人肠道类器官中凝集素异质性与EPEC黏附相关：人结肠和空肠类器官来源2D单层中，EPEC可黏附并注入效应蛋白形成基座。ConA染色显示细胞间表面聚糖异质性：结肠单层多数细胞强染色，空肠多数低染色，仅小亚群强染色。EPEC微菌落主要与低ConA染色细胞相关，呈负相关。12个独立分离EPEC野生型菌落均为T1F-OFF，提示主要BFP介导。内源N-聚糖呈递变异可调节宿主易感性；结肠高ConA细胞较多，提示人肠道区域糖基化差异可能贡献EPEC组织嗜性。

讨论部分总结：两个独立宿主靶向遗传筛选鉴定EPEC感染所需因子，poly-LacNAc N-糖基化途径基因在两项筛选中均居前。LacNAc是BFP黏附必需，扩展并加强先前观察。LacNAc生物合成破坏导致末端甘露糖暴露，强烈促进表达甘露糖结合T1F的EPEC相变体黏附；因此LacNAc介导黏附受损时，EPEC可通过上调T1F补偿。N-糖基化途径扰动还诱导宿主细胞表面蛋白质组广泛变化，反映其在高尔基蛋白分选中的作用，并与T3SS效应子递送减少相关，可能因丢失最佳T3SS停靠所需宿主表面因子。人肠道类器官证据提示，肠道内细胞表面糖基化变异可能贡献EPEC组织嗜性。临床研究强调BFP重要性；人实验感染中bfpA突变和BFP调节子perA突变症状显著少于野生型；非典型EPEC缺乏BFP增加但病情较轻；70个分离株分析中致死病例仅与表达BFP的典型EPEC相关。可溶性LacNAc或LacNAc-BSA可抑制BFP依赖黏附，使LacNAc或LacNAc与甘露糖混合物成为潜在抑制剂。研究结果提示N-糖基化除形成受体外，还通过调节膜相关蛋白质组维持宿主膜功能景观。研究人员推测MGAT1敲除中CAVIN1、整合素和galectin-3耗竭导致特化膜微域崩溃，为T3SS效应子递送减少提供合理解释。表面蛋白质组结果提示N-糖基化还调节CRISPR筛选命中宿主因子如ARPC4、SPTBN1、CTNND1的膜关联。不能排除特定N-糖基化蛋白为EPEC T3SS活性所需，例如副溶血弧菌T3SS2转位子插入需要宿主细胞表面岩藻糖化聚糖。EPEC偏好婴儿小肠，但组织嗜性机制仅部分理解。ConA染色显示结肠类器官比空肠强，提示结肠上皮甘露糖富集聚糖较多、末端LacNAc结构较少，EPEC黏附在结肠单层显著减少；少数黏附微菌落位于ConA弱染色区域。这些发现提示空肠复杂聚糖丰度较高可能贡献EPEC偏好定植小肠。所有12个独立分离EPEC野生型菌落均为T1F-OFF，类器官黏附模式最符合BFP识别含LacNAc聚糖而非T1F依赖结合。除糖基化外，肌动蛋白调控基因在筛选中突出，多数Arp2/3复合物组分及CDC42、WASL在毒性筛选富集；Tir转位筛选鉴定ACTR10和AIF1L，后者先前与志贺菌T3SS介导的肌动蛋白重排相关。其他命中包括KMT2D、ZNF619、STK11和STK17B，其机制作用仍需验证和阐明。局限性指出，研究使用培养上皮细胞和人肠道类器官，不能完全复现肠道环境复杂性；缺乏稳健EPEC感染动物模型，使宿主N-糖基化对感染和组织嗜性的贡献仍具挑战。

研究结论翻译：总之，研究人员的结果确立宿主N-糖基化是EPEC感染的核心决定因素。除确认其在细菌黏附中的作用外，这项工作揭示N-糖基化对有效T3SS效应子递送必不可少，并可能参与EPEC对小肠的组织嗜性。这些见解扩展了对宿主-病原体相互作用的理解，并为靶向宿主糖基化途径以调节细菌毒力开辟新途径。