《Journal of Imaging》：Comparative Evaluation of En Bloc Staining Protocols for Deep-Learning Segmentation of Dorsal Root Ganglia in SBF-SEM
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摘要：将深度学习算法整合到体积电子显微镜中可能受限于生化样品制备。强调重金属对比度的整体染色方案是针对人类视觉解读的便利性而优化的。本研究评估了三种染色方案对背根神经节（DRG）自动分割和三维重建的适用性：基于rOTO的重金属染色（Ellisman）、标准透射
摘要：将深度学习算法整合到体积电子显微镜中可能受限于生化样品制备。强调重金属对比度的整体染色方案是针对人类视觉解读的便利性而优化的。本研究评估了三种染色方案对背根神经节（DRG）自动分割和三维重建的适用性：基于rOTO的重金属染色（Ellisman）、标准透射电子显微镜（TEM）染色（Palade）和无铀整体染色（X-solution）。研究人员将基于U-Net的深度学习模型应用于背根神经节（DRG）样本，以分割细胞核、线粒体、卫星胶质细胞（SGCs）和内质网（ER）。定量分割性能采用Dice相似系数（DSC）和交并比（IoU）进行评估，针对每种染色方案的30张手动标注真值（GT）切片与自动预测掩膜之间的比较，按各分割结构组进行评价。尽管Ellisman染色样本产生了强烈的超微结构对比度，但在若干结构中观察到更多的假阳性和假阴性区域。Palade方案提供的膜对比度不足以在此数据集中可靠识别内质网。相比之下，无铀方案在卫星胶质细胞和线粒体方面产生了最高的DSC和IoU值，并且其内质网分割评分高于Ellisman方案。
一、研究背景与研究目的
理解周围神经系统的三维（3D）细胞结构对于表征感觉功能和神经病理学的形态学基础至关重要。背根神经节（DRG）是一种复杂的异质性组织，由被卫星胶质细胞（SGCs）包裹的假单极感觉神经元组成。由于其高脂质含量和复杂的膜交互指状突起，利用体积电子显微镜（vEM）对其进行成像颇具挑战。传统的透射电子显微镜（TEM）虽然能提供细胞器超微结构的洞察，但其依赖超薄二维切片，使得长程轴突连续性和大规模细胞器组织的分析变得更为繁琐且技术要求高。
为了克服二维成像的局限性，序列块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）等技术应运而生，能够实现自动化获取具有各向同性或近各向同性体素分辨率的对齐图像堆栈。然而，SBF-SEM的图像对比度依赖于生物结构上结合的重金属分布。同时，样品必须具备足够的导电性以消散电荷，防止充电伪影。因此，需要开发激进的“整体染色”方案。传统方案如Palade方案在SBF-SEM中常显不足，而Ellisman的rOTO方案虽广泛使用，但涉及危险试剂、耗时且易产生沉淀伪影。此外，出于对放射性材料处理的担忧，基于镧系元素（如镱）的无铀替代方案（如X-solution）展现出潜力，但其对DRG等复杂组织自动分割的适用性尚未确立。本研究旨在系统比较这三种染色方案在DRG三维重建中的分割保真度、操作效率和技术可行性。
二、研究内容与结论
研究人员对来自健康BALB/c小鼠的三个存档DRG的SBF-SEM数据集进行了回顾性分析，这三个数据集分别对应改良的Palade方案、Ellisman的rOTO方案和无铀的X-solution方案。所有数据集均经过相同的固定预处理流程后，应用基于U-Net架构的深度学习模型对四个目标结构——卫星胶质细胞（SGCs）、细胞核、线粒体和内质网（ER）——进行分割。定量评估采用了Dice相似系数（DSC）和交并比（IoU）两种指标，在每种染色方案的30张Z轴分层切片上进行。
研究得出结论：染色方案优化于传统电镜并不等同于能为自动分割和三维重建提供同等性能。不同结构的分割表现存在显著差异。细胞核分割在所有方案中均高度稳健。对于SGCs和线粒体，无铀的X-solution方案获得了最高的DSC和IoU值。内质网在Palade方案中无法可靠区分，而在可评估的方案中，X-solution的内质网分割评分优于Ellisman方案。总体而言，最强的视觉超微结构对比度并不一定对应最高的分割重叠度。X-solution作为一种无铀替代方案，在DRG组织的AI辅助分析和体积重建中显示出巨大潜力，尤其适用于形态复杂或碎片化的目标结构。
三、关键技术方法
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生物学样本与成像：使用了来自健康BALB/c小鼠的三个存档DRG的SBF-SEM数据集，分别经Palade、Ellisman和X-solution三种整体染色方案处理。图像采集使用配备腔内超薄切片机和背散射电子（BSE）探测器的Zeiss GeminiSEM 360，切片厚度统一为50 nm。
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计算工作流与预处理：在ZEISS Arivis Pro环境中通过自定义Python脚本执行多阶段预处理，包括非局部均值去噪、全局Z-score归一化、限制对比度自适应直方图均衡化（CLAHE）和锐化。
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模型训练与评估：采用Arivis Pro内置的主动学习策略，基于U-Net架构训练模型。细胞核和SGCs使用联合训练的模型，线粒体和内质网则使用独立模型。性能评估采用DSC和IoU，在每种染色方案的30张手动标注真值（GT）切片上进行。
四、研究结果
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3.1 DRG感觉神经元单元的3D体积重建：通过比较原始二维正切切片及其对应的三维体积模型，展示了三种染色方法在图像对比度和所得形态学信息上的差异。Palade方案无法可靠区分内质网（ER），因此三维重建缺乏ER网络。Ellisman方案提供了高对比度的rOTO膜染色，成功重建了所有目标结构。无铀的X-solution方案同样清晰描绘了ER，其三维重建完整包含了细胞核、线粒体、SGC鞘和ER网络。
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3.2 跨DRG区域的定量分割性能：定量数据显示了三种染色方案间的分割性能差异。细胞核分割在所有方案中均高度稳健。X-solution方案在SGCs和线粒体上获得了最高的DSC和IoU值。由于对比度不足，Palade方案无法量化ER分割。
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3.3 卫星胶质细胞（SGCs）的自动分割：定量评估显示，X-solution方案与真值掩膜的重叠最高（DSC: 0.9072, IoU: 0.8334），Palade方案次之，而Ellisman方案表现最差。误差图分析表明，Palade方案边界预测最为保守，假阳性泄漏最少；而Ellisman和X-solution方案均出现一定的边界过分割。
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3.4 神经元细胞核的自动分割：所有三种方案的细胞核分割均非常成功，DSC值均超过0.98。Ellisman方案获得了最高的DSC和IoU值。但Palade方案的预测-真值差异图显示其在核边界处存在一圈明显的假阳性预测，暗示核边界略有高估。
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3.5 线粒体的自动分割：线粒体分割在各方案间差异显著。X-solution方案获得了最高的DSC（0.9242）和IoU（0.8592）值，Ellisman方案次之，Palade方案最低。空间差异图显示，X-solution方案更高的分数与其更完整的真值掩膜覆盖和更少的假阴性区域相关。
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3.6 内质网（ER）的自动分割：ER是最具挑战性的结构。Palade方案因对比度不足被排除。在可评估的方案中，X-solution方案获得了比Ellisman方案更高的DSC和IoU值（DSC: 0.5941 vs. 0.4989; IoU: 0.4238 vs. 0.3340）。视觉分析显示，Ellisman模型存在严重的欠分割，而X-solution模型灵敏度更高，捕获了更多真阳性区域，尽管也伴随更多假阳性预测。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，传统电镜染色方案通常优化以提供强视觉对比度，但本研究发现，最强的视觉对比度并不必然带来最佳的自动分割性能。Ellisman方案的高对比度图像伴随着局部强度不均和类似沉淀的特征，可能导致分割错误。而视觉上更均匀的X-solution图像在多个复杂结构上取得了更高的分割得分，表明局部对比度一致性和结构特异性可能影响模型性能。
研究结论明确指出，在本研究考察的数据集和工作流程中，Palade方案未能为内质网（ER）的可靠识别提供足够膜对比度；Ellisman方案虽能分割所有结构，但伴随局部强度异质性和更多假阳性/假阴性区域；X-solution方案则在SGCs和线粒体上获得了最高的DSC和IoU值，其ER分割评分也高于Ellisman方案，同时保持了高的细胞核分割精度。因此，X-solution代表了一种有前景的无铀替代方案，尤其适用于形态复杂或碎片化的结构，并为寻求替代染色试剂的实验室提供了实用优势。
