小鼠骨骼肌运动神经元成熟中胚胎身份消退与成年功能亚型重建的时序单核多组学解析

《Cell Reports》：Collapse of embryonic identities and emergence of functional diversity during motor neuron maturation

　　

有丝分裂后神经元（post-mitotic neurons）在轴突延伸至靶标、形成突触并优化电生理特性的过程中经历延长的成熟期。研究人员采用时序单核多组学测序（temporal single-nucleus multiome sequencing）绘制小鼠骨骼肌运动神经元（skeletal motor neurons, SMNs）成熟的分子基础。数据表明，SMNs在成熟过程中发生转录变化；更显著的是，研究人员发现SMNs内部多样性在从轴突靶向向形成功能回路转变期间发生剧烈变化。胚胎期SMNs包含数十个转录亚簇，代表已知运动柱（motor columns）和运动池（motor pools），其利用特定转录程序支配独特肌肉靶标。然而，该转录多样性在出生后早期大部分丢失，SMNs再多样化（re-diversify）为成年alpha、gamma和type3身份，其支配每块肌肉内不同纤维以调控运动。该工作表明，某一神经元类型内的转录亚型多样性及其潜在调控程序可在成熟过程中完全转变，以适应变化的功能需求。

研究背景与问题：成年神经元在形态、回路和生理上高度多样。该多样性在胚胎发育期启动，祖细胞和新生有丝分裂后神经元响应空间信号激活独特基因表达程序，随后经历延长成熟期，完成轴突投射、回路整合和突触精炼。近期基因组学研究表明，成熟伴随神经元类型特异性转录变化，且不同神经元类型获得成年多样性的轨迹不同：背根神经节感觉神经元在胚胎指定后较均一、出生后早期多样化；皮质抑制性和兴奋性神经元从胚胎到出生后更为多样；下丘脑视前区神经元在胚胎期已高度多样并维持至成年。小鼠骨骼肌运动神经元（SMNs）在胚胎期分化为数十个运动柱（motor columns）和运动池（motor pools）身份以保证肌肉靶向，而成年SMNs单核RNA-seq仅显示alpha、gamma和type3三种主要转录身份；alpha支配肌外纤维，gamma支配肌梭内纤维，type3/beta支配两者。alpha和gamma在肌萎缩侧索硬化中易感性不同。胚胎多样性如何、何时转变为成年多样性尚不清楚。

研究人员开展的研究与结论意义：研究人员对小鼠脊髓胆碱能神经元进行时序单核多组学测序（single-nucleus multiome sequencing, snMultiome）和单核RNA-seq（snRNA-seq），覆盖胚胎、出生后早期、 juvenile和成年阶段，发现SMNs多样性随成熟呈“沙漏形”波动：胚胎期高度多样，围产期塌缩，出生后重新多样化为alpha、gamma和type3。研究意义在于揭示长期存活的终末分化神经元类型可在成熟中完全重塑转录亚型多样性，以适应功能需求。

关键技术方法：研究人员采用snMultiome和snRNA-seq。样本来源为小鼠脊髓颈段和腰段：snMultiome使用Chat-Cre;Sun1-sfGFP-myc小鼠在E15.5、P3、P7、P13、P21、P56分选GFP⁺核；snRNA-seq使用E15.5、P5、P26样本，部分出生后经AAV-flex-KASH-GFP标记Chat-Cre小鼠。另结合HCR RNA FISH、免疫染色、增强子AAV报告、Seurat/Signac/chromVAR/JASPAR2020等分析。忽略试剂和具体构建步骤。

研究结果：
成熟脊髓胆碱能神经元的时序单核snMultiome图谱：研究人员在六个时间点获得44,088个总核，snRNA-seq获得23,848个总核，鉴定Chat⁺Slc5a7⁺ SMNs、前神经节运动神经元（preganglionic motor neurons, PGMNs）和胆碱能中间神经元等。结论是建立了从胚胎到成年的脊髓胆碱能神经元成熟轨迹。

骨骼肌运动神经元多样性在成熟过程中变化：研究人员合并SMNs聚类，发现E15.5 SMNs分为数十个小簇，P3约78%进入3个主簇，P13后簇间差异再次增加；独立随机抽样、Pearson相关和PC距离均支持“沙漏形”轨迹；独立snRNA-seq验证相似趋势；PGMNs多样性不随时间波动。结论是SMN转录多样性在成熟中先降低后升高。

胚胎SMN的广泛运动柱和运动池多样性在成熟中丢失：E15.5簇对应已知五个运动柱及多个池；列和池基因模块至P13基本消失；标签转移显示成年仅31% SMNs显著匹配E15.5簇，且仅匹配9/43簇，既往成人SMN数据结果相似；PGMN中>90% P21细胞保留E15.5匹配。E15.5簇特异性开放染色质峰中79%随成熟失去可及性；74个E15.5簇富集转录因子（transcription factors, TFs）中60%下调，免疫染色验证Lhx1、Nkx6-1、Nr2f2、Bcl11b、Lhx3、Satb2等下降。结论是胚胎运动柱/池身份在成熟中 largely 丢失，未在染色质可及性中保留。

成年alpha、gamma和type3身份在成熟过程中逐步建立：研究人员用成年亚型基因模块和P21标签转移发现，alpha和gamma身份在E15.5至P3/P5间出现，type3在P5至P7间出现；亚型标记基因并非同时激活，gamma基因最早，alpha次之，type3再次；RNA FISH验证早期和晚期标记。alpha亚群可区分潜在快疲劳型（fast firing fatigable, FF）、快抗疲劳型（fast firing fatigue resistant, FR）和慢抗疲劳型（slow firing fatigue resistant, SR），SR基因与type3共享。结论是成人SMN亚型按gamma、alpha、type3顺序逐步获得。

alpha、gamma和type3身份由时序激活的染色质区域和TFs定义：研究人员鉴定P21/P56亚型特异性开放染色质峰，gamma峰最早在P3接近成年状态，alpha和type3更渐进；增强子AAV报告显示alpha增强子在NEUN⁺细胞表达而不在ESRRG⁺细胞，gamma增强子在ESRRG⁺ SMNs表达而不在NEUN⁺；突变gamma增强子中的CRE基序消除gamma表达。基序富集显示gamma富集CRE/NR，type3富集ROR/POU，alpha/type3富集GRE，alpha富集NFI；候选TFs包括Creb5、Esrrg、Nr3c2、Rora、Pou3f2、Nfia/Nfib，并验证NFIA/NFIB偏向ESRRG^-，CREB5偏向ESRRG⁺。结论是亚型特异TFs与共享活动依赖因子共同驱动成人亚型逐步获得。

讨论总结与研究结论翻译：讨论指出，SMNs代表第三种成熟轨迹，即多样性波动型：胚胎期分化为空间身份，围产期丢失，出生后前三周重新分化为功能身份并维持至成年。该过程与运动行为、皮质脊髓投射、脑干5-羟色胺能投射、肌肉和神经肌肉接头成熟平行。SMN基因调控呈逐步模式，而非单一终末选择因子维持：初始由Isl1/Lhx3指定，随后柱/池TFs激活并下调，之后成人亚型TFs和活动依赖TFs作用。限制包括单核数据可能漏低表达基因、alpha小簇功能未明、未鉴定抑制因子。研究结论翻译：该工作显示，SMNs从胚胎到新生儿到成熟阶段的多样性剧烈波动；胚胎期运动池和柱身份在轴突到达肌肉后丢失，尽管神经肌肉回路终生维持；随后SMNs再多样化为alpha、gamma和type3/beta身份，并维持至成年；表明神经元类型内转录多样性及其调控程序可随功能需求改变；成人SMN亚型以逐步方式获得，可能由亚型特异转录调控因子与共享活动依赖因子共同控制。