超临界流体提取的 Johernia aromatica 提取物对冷冻虹鳟（Oncorhynchus mykiss）鱼块晚期糖基化终末产物（AGEs）形成及氧化稳定性的影响

《Applied Food Research》：Influence of Supercritical Fluid-Extracted Johernia aromatica Extract on Advanced Glycation End Products and Oxidative Stability of Rainbow Trout Nuggets During Frozen Storage

　　

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）主要经还原糖与蛋白质或脂质之间的美拉德反应（Maillard reaction）生成，广泛与多种慢性疾病的发生发展相关。本研究考察了超临界流体提取的 Johernia aromatica（syn. Johrenia aromatica）提取物对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）鱼块在?20°C冷冻贮藏0、7、15和30天期间AGEs形成、氧化稳定性及美拉德反应进程的影响。制备八种实验处理，包括新鲜对照、冷冻对照、合成抗氧化剂对照（BHT 200 ppm）、两种额外低浓度处理（0.25%和0.5%）以及三种分别添加1%、2%和3%（w/w）J. aromatica提取物的冷冻样品。通过过氧化值（peroxide value, PV）、游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）含量和丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平评价脂质氧化，通过测定游离巯基（sulfhydryl, SH）评价蛋白质氧化。采用DPPH自由基清除和FRAP试验测定抗氧化活性。通过离心后295和420 nm处吸光度监测美拉德反应进程及游离类黑精，通过测定乙二醛（glyoxal）、N^ε-羧甲基赖氨酸（N^ε-carboxymethyl lysine, CML）、戊糖苷素（pentosidine）和总荧光AGEs定量AGEs形成。与新鲜样品相比，冷冻贮藏显著增加脂质氧化指标、美拉德反应产物和AGEs积累（P < 0.05）。相反，与冷冻对照相比，加入J. aromatica提取物显著降低PV、FFA、MDA、乙二醛、CML、戊糖苷素和荧光AGEs（P < 0.05）。3%提取物处理在抑制脂质氧化和AGEs形成方面与BHT（200 ppm）效果相当（P > 0.05）。最低有效浓度（minimum effective concentration, MEC）确定为1%。此外，提取物处理样品表现出显著更高的抗氧化能力和游离巯基含量（P < 0.05）。在2%和3%提取物水平观察到最强保护作用。这些发现表明，超临界流体提取的J. aromatica提取物有效抑制冷冻鱼制品中AGEs形成、脂质过氧化和蛋白质氧化，凸显其作为冷冻海产品工业天然防腐剂的潜在应用。

作者 Tayebeh Rostami Aryan 与 Mohammad Hossein Azizi 围绕冷冻虹鳟鱼块品质劣变与AGEs积累问题开展了研究。研究背景在于，AGEs是还原糖与蛋白质、脂质或核酸的自由氨基发生非酶反应形成的化合物，常通过美拉德反应产生，并可因热和氧化条件增强；其积累与糖尿病、心血管疾病、肾功能障碍、神经退行性疾病和癌症等有关。膳食是AGEs的重要外源来源，动物性食品尤其是富含蛋白质和脂质并经干热烹调者贡献较大。虹鳟等鱼类富含优质蛋白及omega-3长链多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA, 20:5n-3）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA, 22:6n-3），但这一脂质组成使其易发生氧化降解。冷冻贮藏虽常用于海产品保藏，但冰晶形成会破坏肌肉细胞膜，促使促氧化酶和金属离子释放，加速脂质和蛋白质氧化；脂质氧化产生的活性羰基化合物还可推动美拉德反应和AGEs形成。消费者对清洁标签食品的需求增加，使天然植物来源抗氧化剂替代合成防腐剂受到关注。Johernia aromatica（syn. Johrenia aromatica）为 Apiaceae（Umbelliferae）科食用芳香植物，原产于伊朗，常见于Kermanshah省山区，传统上作为烹饪草本和调味剂使用，已知含酚酸、黄酮类和萜类等具有抗氧化和抗菌活性的生物活性成分。超临界流体提取（supercritical fluid extraction, SFE）使用CO₂，具有无有机溶剂残留、选择性好、可保护热敏化合物等优点。但SFE来源J. aromatica提取物对冷冻鱼制品AGEs形成和氧化稳定性的影响尚未见研究。因此，研究人员评估该提取物对?20°C冷冻贮藏30天虹鳟鱼块脂质氧化、蛋白质氧化、抗氧化能力、美拉德反应进程和AGEs形成的影响，以支持其作为天然防腐剂的应用。

关键技术方法概括不超过250字：新鲜虹鳟来自当地水产养殖场，平均体重300–400 g；J. aromatica新鲜地上部分于春季采自伊朗Kermanshah省山区，经植物学鉴定、阴干。采用SFE系统，以CO₂为溶剂，条件为300 bar、50°C、90 min、CO₂流速2 L/min，提取物得率为4.2 ± 0.3%（w/w）。鱼块基础配方为碎鱼70%、小麦粉15%、水10%、盐2%、香辛料2%、洋葱粉1%，加入0.25%、0.5%、1%、2%、3%（w/w）提取物，并设BHT 200 ppm对照。经裹糊、裹粉、180 ± 2°C预炸2 min后，?20°C贮藏30天，分别于0、7、15、30天取样，测定脂质、蛋白质氧化、抗氧化、美拉德产物、AGEs和总活菌数（total viable count, TVC），数据以SAS 9.4进行方差分析和对比分析。

研究结果中，超临界流体提取的J. aromatica提取物总酚含量为1.53 ± 0.07 mg GAE/g提取物，表明存在相当量酚类化合物；随着鱼块中提取物添加浓度增加，酚类负荷相应增加，并伴随抗氧化活性和抑制氧化及糖化相关反应改善。3.1 对脂质和蛋白质氧化的影响：通过测定0、7、15、30天PV、FFA、MDA和SH发现，冷冻贮藏显著加速脂质氧化，冷冻对照PV等显著高于新鲜对照（P < 0.05），快速上升主要发生在前15天；FFA显著升高，说明?20°C下脂解活性未被完全抑制；MDA也显著升高，表明二级脂质氧化进行；SH含量显著下降，反映硫醇基团氧化为二硫键。加入J. aromatica提取物后，各处理PV显著降低（P < 0.05），3%处理与BHT 200 ppm效果相当（P > 0.05），MEC为1%，0.25%和0.5%仅部分保护，3%对初级脂质氧化抑制最强；2%和3%显著降低FFA和MDA，表明抑制脂质水解和次级氧化；2%和3%最能保留SH。其保护作用与酚类和黄酮类作为氢供体、自由基清除剂，螯合Fe²⁺和Cu²⁺等过渡金属，减少Fenton型反应，抑制脂酶或限制底物可及性，以及酚类与蛋白结构相互作用保护反应性硫醇等有关。总体表明提取物有效抑制冷冻虹鳟鱼块脂质和蛋白质氧化，较高添加量效果更强。

3.2 对J. aromatica提取物抗氧化能力的影响：通过DPPH自由基清除和FRAP测定发现，冷冻对照的DPPH清除活性和FRAP值显著低于新鲜对照（P < 0.05），说明冷冻贮藏降低内源抗氧化物质。加入提取物后，DPPH清除活性显著高于冷冻对照（P < 0.05），2%和3%最高且二者无显著差异（P > 0.05）；提取物IC₅₀为1.8 mg/mL。FRAP结果相似，所有提取物处理组还原力显著高于冷冻对照（P < 0.05），2%和3%最高。研究人员认为，这与J. aromatica中酚类和黄酮类的羟基及芳香结构可有效供氢、中和自由基有关；SFE可能有助于保护热敏生物活性成分并提高提取物纯度，但尚需与浸提、Soxhlet等方法比较确认。结论为SFE来源J. aromatica提取物有助于在冷冻贮藏中维持抗氧化能力。

3.3 对J. aromatica提取物对美拉德反应产物和AGEs的影响：通过测定A₂₉₅、A₄₂₀、乙二醛、CML、戊糖苷素和总荧光AGEs发现，冷冻贮藏期间美拉德反应虽速率降低但仍可进行。冷冻对照A₂₉₅和A₄₂₀显著高于新鲜对照（P < 0.05），前者在7–15天增加最快，后者反映类黑精形成；提取物显著降低A₂₉₅和A₄₂₀，2%和3%最低，说明抑制早期糖化反应和晚期美拉德产物。乙二醛作为高反应性二羰基化合物和AGEs前体，在冷冻对照中显著升高（P < 0.05），提取物显著降低其水平，3%最低，可能与减少前体形成和酚类直接捕获活性羰基有关。CML在冷冻对照中显著增加（P < 0.05），提取物处理显著降低，3%降幅最大。海产品中长链多不饱和脂肪酸含量高，易脂质自氧化，脂质氢过氧化物分解形成乙二醛和甲基乙二醛等活性α-二羰基化合物，可直接糖化蛋白质形成CML和戊糖苷素等AGEs；本研究中脂质氧化指标PV、MDA与AGEs指标CML、戊糖苷素呈强正相关，支持冷冻鱼制品中该机制联系。戊糖苷素在冷冻贮藏中显著增加，2%和3%提取物抑制最强（P < 0.05）。总荧光AGEs在冷冻对照中显著升高（P < 0.05），所有提取物处理均显著低于冷冻对照，2%和3%最低且无显著差异（P > 0.05）。与已发表天然防腐剂相比，3% J. aromatica提取物在30天后使MDA降低约37%、CML降低约25%，与迷迭香提取物、番石榴叶多酚等报道效果相当或略优，但直接比较应谨慎，因食品基质、提取方法、浓度和贮藏条件不同。非线性回归显示，抑制CML和荧光AGEs的EC₅₀分别约为1.2%和1.0%（w/w），证实剂量依赖性保护作用。抑制机制可能包括螯合过渡金属离子、清除活性氧、降低氧化应激、捕获乙二醛等活性二羰基化合物以及干扰糖–蛋白相互作用；槲皮素等黄酮类可通过类似机制抑制AGEs形成。总体表明J. aromatica提取物对虹鳟鱼块AGEs形成具有明显浓度依赖性降低作用。

讨论部分总结：研究指出，冷冻贮藏不能完全阻止生化反应，提取物保护作用与其酚类含量及清除活性氧、螯合促氧化金属离子、抑制脂质水解、保留蛋白巯基、减少糖化途径中活性二羰基中间体形成有关；相关分析确认脂质氧化标志物与AGEs形成之间强正相关，支持二者在冷冻鱼制品中的机制联系。作者也指出局限：未对J. aromatica提取物中生物活性化合物进行详细化学表征，如HPLC-DAD或LC-MS/MS酚类谱；缺乏终产品感官评价，需确定1–3%浓度范围对风味、香气、质地和总体可接受性的影响；虽进行了TVC，但未评估特定病原菌、提取物对脂解酶活性及金属螯合能力的影响。未来研究应开展先进分析技术下的全面植物化学分析、消费者感官评价、酶抑制机制研究、不同贮藏条件下货架期研究，并探索与其他天然抗氧化剂的协同组合以降低所需浓度。研究结论部分翻译如下：本研究证明，虹鳟鱼块在?20°C冷冻贮藏30天显著促进脂质和蛋白质氧化，降低抗氧化能力，加剧美拉德反应进程并增加AGEs积累。具体而言，冷冻对照与新鲜对照相比，PV从5.27增至12.17 meq/kg（增加131%），MDA从0.877增至1.897 mg/kg（增加116%），CML从3.473增至8.710 μg/g（增加151%）。加入超临界流体提取的Johernia aromatica提取物可有效缓解这些不良变化，尤其在2%和3%添加水平；3%提取物处理在抑制脂质氧化和AGEs形成方面与BHT 200 ppm效果相当，二者无显著差异（P > 0.05）。最低有效浓度确定为1%，因较低浓度0.25%和0.5%仅提供部分保护。提取物保护作用与其酚类含量（1.53 mg GAE/g）及清除活性氧（3%时DPPH抑制率最高达23.6%）、螯合促氧化金属离子、抑制脂质水解、保留蛋白质巯基、减少糖化途径中活性二羰基中间体形成的能力有关。相关分析确认脂质氧化标志物与AGEs形成之间强正相关，支持冷冻鱼制品中这些过程的机制联系。因此，提取物处理样品在冷冻贮藏期间脂质过氧化产物、蛋白质氧化、美拉德反应标志物以及特异性和荧光AGEs均显著降低。总体而言，这些发现表明超临界流体提取的J. aromatica提取物作为冷冻海产品天然安全防腐剂具有较强潜力；2–3%浓度显示最佳效果，但商业应用可能需要感官验证和成本效益分析。未来研究应探索与其他天然抗氧化剂的协同组合以在不牺牲保护效果的情况下降低所需浓度，并开展全面感官评价和详细鉴定负责观察效应的生物活性化合物。该提取物的应用可能有助于改善氧化稳定性、提高营养品质并减少潜在有害AGEs形成，支持其用于清洁标签冷冻鱼产品开发。