《iScience》：DeepNPA: A protBert-based framework for residue-level annotation of neuropeptide precursors
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神经肽是调节神经和内分泌系统的关键信号分子，其成熟依赖于前体蛋白的精确蛋白水解裂解。然而，残基级注释仍然至关重要但实验工作量大，且专门的计算工具有限。在此，研究人员提出了DeepNPA，一个残基级注释框架，该框架整合了预训练蛋白质语言模型ProtBert与用于
神经肽是调节神经和内分泌系统的关键信号分子，其成熟依赖于前体蛋白的精确蛋白水解裂解。然而，残基级注释仍然至关重要但实验工作量大，且专门的计算工具有限。在此，研究人员提出了DeepNPA，一个残基级注释框架，该框架整合了预训练蛋白质语言模型ProtBert与用于不平衡感知优化的焦点损失（Focal Loss, FL）。DeepNPA在采用BIO（Begin-Inside-Other）方案注释的非冗余Swiss-Prot衍生数据集上进行了训练和评估。在独立测试数据集上，DeepNPA取得了优异的性能，准确率（Accuracy, ACC）为0.953，F1分数（F1-score）为0.927，精确率-召回率曲线下面积（Area Under the Precision-Recall Curve, AUPRC）为0.965。在独立基准数据集上，DeepNPA优于NeuroCS和NeuroPred，ACC达到0.969，马修斯相关系数（Matthews Correlation Coefficient, MCC）为0.666。外部验证进一步证明了其识别神经肽区域及其相关裂解位点的能力。此外，研究人员提供了一个在线预测平台，以促进神经肽前体注释和裂解位点分析。
论文解读
一、研究背景与问题
神经肽是介导细胞间通讯的关键信号分子，广泛参与神经调节、代谢调控和免疫调节等多项生物过程。这些生物活性分子由较大的神经肽前体（Neuropeptide Precursors, NPPs）通过高度特异且严格调控的蛋白水解裂解事件合成，主要经G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPCRs）发挥作用，调节伤害感受、能量稳态、情绪行为和认知过程等生理功能。由于其在生理调控和疾病中的核心作用，神经肽已成为神经和代谢疾病潜在治疗靶点，准确识别和注释神经肽对于阐明内源性信号机制和促进相关功能研究至关重要。
然而，神经肽及其裂解模式的实验鉴定耗时费力且技术要求高。现有计算方法主要集中在两个任务：识别神经肽前体或预测其蛋白水解裂解位点。例如，研究人员此前开发的NeuroPP利用优化的氨基酸组成特征识别神经肽前体，NeuroCS则通过增强特征工程和支持向量机分类器预测前体内的裂解位点。NeuroPred是另一个广泛使用的激素原裂解位点预测框架，最初基于统计和基序预测模型，后逐步引入机器学习和人工智能方法。尽管这些工具推动了领域发展，但能够直接为前体序列分配残基级标签的专用计算工具仍然有限。残基级注释的重要性在于它不仅能够识别裂解边界，还能描绘前体蛋白内的神经肽区域，从而提供神经肽成熟的更全面视图。然而，神经肽前体存在固有的严重类别不平衡问题——裂解位点仅占残基的极小部分，这可能导致模型偏向主要类别并降低检测真实裂解位点的灵敏度。
二、研究内容与结论
为解决上述局限性，研究人员提出了DeepNPA，一个用于神经肽前体残基级注释的框架。DeepNPA整合了在大规模蛋白质序列语料库上预训练的蛋白质语言模型ProtBert与焦点损失（FL），通过强调难以分类的实例来缓解类别不平衡。ProtBert提供深度上下文嵌入，捕获生化和进化信息，增强特征提取；FL降低易分类残基的权重，聚焦于学习代表性不足的裂解位点。研究人员系统评估了DeepNPA在不同超参数配置下的性能，并与NeuroCS和NeuroPred进行了基准比较。DeepNPA取得了稳健的预测性能并持续优于现有方法。外部验证进一步表明DeepNPA能有效描绘神经肽前体内的神经肽区域。最后，研究人员开发了用户友好的在线平台，为神经肽前体注释、裂解位点分析和下游神经肽组学研究提供了宝贵资源。
三、主要技术方法
研究人员从UniProtKB/Swiss-Prot数据库收集人工审阅的神经肽前体序列及成熟神经肽区域的位置注释，采用BIO标记方案进行序列标注，并使用CD-HIT以0.9序列同一性阈值去冗余，获得685条非冗余序列，按7:1:2比例划分为训练集、验证集和独立测试集。模型架构采用ProtBert编码器进行上下文表示学习，线性分类头进行BIO标签预测，并以焦点损失作为优化目标。对于超过512个氨基酸的序列，采用滑动窗口策略（窗口长度512，重叠64残基）处理。独立基准数据集通过去除与NeuroCS和NeuroPred训练集重叠的序列并以0.4阈值去冗余构建，包含50条序列。外部验证数据集来自海参（Stichopus cf. horrens和Holothuria scabra）的质谱验证神经肽数据，包含16条前体序列。
四、研究结果
数据集统计特征。 共获得来自7个门273个物种的1,500条神经肽前体序列，包含1,577个B标签、20,052个I标签和43,231个O标签，O标签占66.65%，呈现高度不平衡的残基分布。序列长度范围为4至2,731个氨基酸，多数分布在4至350个残基之间。
DeepNPA在独立测试数据集上的性能。 DeepNPA在独立测试数据集上取得了ACC为0.953、精确率0.923、召回率0.931、F1分数0.927的均衡性能，AUPRC达0.965，受试者工作特征曲线下面积（Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve, AUROC）达0.985。各类别的AUROC分别为O类0.979、B类0.997、I类0.978，AUPRC分别为O类0.976、B类0.964、I类0.975，表明模型在类别不平衡条件下仍能准确检测少数类别。
预训练与优化策略的贡献。 消融研究比较了六种模型变体。BERT基模型在不同损失函数下表现较低且不稳定，最佳变体BERT-FL的ACC为0.918、F1为0.865、MCC为0.844。ProtBert-CE（ACC 0.878）反而低于BERT-CE（ACC 0.910），表明仅替换为蛋白质特异性预训练并不能一致提升残基级分类性能。但将交叉熵替换为FL后，ProtBert-FL在所有评估指标上均大幅提升，取得ACC 0.926、F1 0.869、MCC 0.857的最佳综合表现。这表明ProtBert编码器与FL的协同组合是DeepNPA性能优势的主要来源。
超参数敏感性分析。 网格搜索覆盖了最大输入序列长度（256和512）、批大小（4、8、16、32）和学习率（1e?5至5e?5）以及FL参数γ（1.0至2.5）和αt的多种配置。最优配置为max_len=512、bs=4、lr=1e?5、γ=1、αt=(1, 8, 2)，取得ACC 0.953、MCC 0.901、F1 0.927、AUPRC 0.965、AUROC 0.985。单变量扰动实验表明，序列长度512优于256，中等批大小（8或16）提供稳定性能，学习率1e?5和2e?5为最优，而5e?5导致性能最差。
与现有模型的比较评估。 在独立基准数据集上，DeepNPA在所有指标上均优于NeuroCS和NeuroPred。DeepNPA的精确率为0.640（NeuroCS为0.350，NeuroPred为0.557），召回率为0.723（NeuroCS为0.379，NeuroPred为0.404），F1分数为0.681（NeuroCS为0.364，NeuroPred为0.468），MCC为0.666（NeuroCS为0.333，NeuroPred为0.450），AUROC为0.854，AUPRC为0.478。在严格非重叠评估设置下的一致性性能提升表明DeepNPA的预测优势源于其改进的建模能力。
t-SNE表示学习解释。 对ProtBert编码器多个层的隐藏表示进行t-SNE可视化。第0层（输入嵌入层）中B、I、O标签几乎完全重叠，仅反映原始序列编码。第4层开始出现弱聚类趋势。第12层（深层编码层）中B类形成紧凑且清晰分离的簇，O和I类内部凝聚性显著增强。分类器输出层中类别边界最清晰，B类紧密聚集且良好隔离，仅少量I标签与O标签重叠，对应预测置信度较低的残基。
外部验证。 在来自棘皮动物门（与训练物种不同门）的外部验证数据集上，DeepNPA的MCC为0.394、F1分数为0.428，显著优于NeuroCS（MCC 0.056、F1 0.033）和NeuroPred（MCC 0.083、F1 0.076）。跨门验证中性能下降可归因于进化分歧导致的序列保守性降低。预测裂解位点的基序分布分析显示，大多数预测位点位于典型的二元基序（KR和RR），与激素原转化酶的已知识别偏好一致。
Web服务器实现。 研究人员开发了公开可访问的DeepNPA在线平台，支持直接粘贴序列或上传FASTA文件，对超过512氨基酸的序列采用滑动窗口策略，最大支持1,500个氨基酸。预测结果以BIO标记方案在残基级别呈现，采用颜色编码（红色B、蓝色I、灰色O）可视化。
五、讨论与结论
研究表明，DeepNPA的性能提升可能归因于上下文序列表示与不平衡感知优化的互补优势。ProtBert捕获长程上下文依赖关系，FL降低丰富非裂解残基在优化中的主导地位，使模型更有效地聚焦于困难且生物学相关的裂解位置。超参数分析表明最大序列长度512的重要性以及FL在高度不平衡设置中的效用。外部验证中性能下降可能归因于训练和测试物种间的进化分歧、序列组成差异及物种特异性加工机制，但DeepNPA在系统发育远缘物种上保持竞争性性能，表明学习到的表示具有有意义的生物学泛化能力而非简单记忆训练样本。
研究局限性包括：部分Swiss-Prot注释可能缺乏肽组学或质谱的直接实验确认；外部评估序列数量相对较少；极端类别不平衡仍是根本挑战；神经肽前体加工本质上受氨基酸序列之外的生物背景影响，包括物种谱系差异、组织特异性表达、发育阶段和生理状态等，这构成纯序列预测模型的内在上限。
未来工作将考虑整合蛋白质语言模型表示与结构感知特征（如预测三维结构、溶剂可及性、残基灵活性、残基接触图和局部构象动力学），以更好地表征神经肽前体加工的序列-结构决定因素。随着跨系统发育多样物种的大规模肽组学和蛋白质组学数据集的可用性增加，整合序列信息、结构特征、生物背景和实验支持知识可能为推进神经肽前体残基级注释提供有前景的框架，并促进跨后生动物物种的未表征生物活性神经肽发现。
