中线丘脑神经元在小鼠失神癫痫发作中表现出早期超同步化

《iScience》：Midline thalamic neurons show early hypersynchrony during absence seizures in mouse models

　　

全身性癫痫发作反映了一种突发的、全局性神经元超同步化的病理状态。支持这种同步化启动与维持的机制仍然未知。研究人员利用两种失神癫痫小鼠模型，通过同步单单元（single-unit）与皮层脑电图（electrocorticographic, ECoG）记录，评估了26个脑结构中约2000个单个神经元的活性。通过这一方法，研究人员解析了全身性癫痫发作前及发作期间单个神经元活动的时间进程。出乎意料的是，研究人员观察到节律性、同步化的活动在丘脑和皮层中均早期且渐进地出现。此外，尽管研究人员观察到大多数结构中的单个神经元在癫痫发作期间呈现节律性同步放电，但一小部分中线丘脑核团表现出跨多个区域的强相关活动。最后，干扰中线丘脑内的神经元活动可终止癫痫发作。因此，研究人员的发现共同凸显了中线丘脑在神经元超同步化出现中的潜在作用。

论文解读：中线丘脑神经元在小鼠失神癫痫发作中的早期超同步化

一、研究背景与问题

神经元同步化是健康大脑的重要特征，支持睡眠、注意力和运动协调等关键功能。然而，异常的神经元同步化常见于多种病理状态，包括精神分裂症、帕金森病和癫痫。与多种癫痫类型相关的全身性发作，其定义特征为多个脑结构突然出现同步化神经元活动。然而，这种病理性超同步化究竟如何产生，甚至其存在程度，至今仍不清楚。

失神癫痫（absence epilepsy）是一种以反复全身性发作为特征的常见儿童期癫痫类型。在人类中，失神发作与多个皮层结构中3-Hz棘慢波放电（spike-wave discharges, SWDs）的快速出现相关，并伴随意识受损。尽管已发现一些与失神癫痫相关的基因突变，但对该疾病病因的清晰理解仍然缺乏。

目前已有多种动物模型用于研究失神癫痫，包括遗传模型（如GAERS和WAG/Rij大鼠，以及Stargazer、Tottering、Lethargic和C3H/HeJ小鼠）和药理模型（如γ-羟基丁酸和青霉素诱导模型）。数十年的研究已确立全身性失神发作由反复的皮层-丘脑-皮层网络产生。离体脑片实验表明，丘脑核团——尤其是外侧结构如外侧膝状体和腹基底核——包含能够产生类似失神发作期间观察到的超同步化神经元振荡的节律发生回路。大鼠模型的在体实验表明，在SWD早期阶段，皮层记录的神经元场活动始终先于丘脑活动。这些研究共同奠定了如今被称为失神发作产生的“皮层焦点理论”（Cortical Focus Theory）的基础，该理论提出过度的皮层活动激活皮层-丘脑-皮层回路，进而支持并招募更多结构，最终产生以SWD形式出现的高度节律性和广泛性的神经元振荡。

然而，近年来的研究提出了新的疑问。多通道细胞外记录显示，皮层和丘脑群体的平均放电率在SWD期间相对于基线活动有所降低，提示同步化的增加而非放电率的升高可能是失神发作的定义性特征。此外，2018年的一项研究证明，尽管在腹基底复合体中选择性阻断T型钙通道，GAERS大鼠的SWD仍然持续，这削弱了丘脑神经元爆发放电在SWD维持中的核心作用。这些发现表明，当前对SWD启动和维持机制的理解仍不完整。

二、研究内容与结论

本研究旨在解析SWD期间出现的神经元同步化的时空动态。研究人员分析了两种失神癫痫小鼠模型（C3H/HeJ和Stargazer小鼠）中SWD前、中、后单个神经元的活动。通过同时记录ECoG信号和单单元活动，研究人员评估了26个脑结构中约2000个神经元的活动。

研究的主要发现包括：第一，SWD以广泛的神经元超同步化为标志，但放电率的变化通常微妙且多变。第二，局部化的超同步化活动簇在SWD发作前（以运动皮层ECoG定义）长达500毫秒时即出现在特定的丘脑核团中，表明丘脑的招募比皮层焦点理论框架内先前认识到的更早。第三，尽管两种模型在皮层表面记录的SWD具有相似的频谱特征，但潜在神经元动态的时间演变不同，表明驱动SWD的回路级机制在模型间存在差异。第四，中线丘脑的高频刺激可中断正在进行的SWD，且在两种小鼠模型中效果不同。

三、主要技术方法

研究人员使用以下关键技术方法开展研究：

1. 1.
   在体电生理记录：在清醒、头部固定的C3H/HeJ（28只，14雄14雌）和Stargazer小鼠（21只，6雄15雌）中，同时记录ECoG信号和单单元活动。使用64或256通道硅探针进行记录，并通过免疫荧光和组织学重建验证探针位置。
2. 2.
   尖峰排序与单元分类：使用Kilosort 2.5进行离线尖峰检测和自动排序，并通过Phy进行人工筛选。基于细胞外波形特征（半幅持续时间和波谷至波峰时间）将单元分类为推定兴奋性或推定抑制性神经元。
3. 3.
   尖峰-场相干性分析：计算神经元放电与ECoG信号之间的相干性，评估神经元群体在SWD期间的振荡活动。
4. 4.
   相位分析：将动作电位时间相对于SWD负向ECoG尖峰的归一化周期进行定义，揭示不同脑结构在SWD周期内的放电时序。
5. 5.
   同步性分析：使用Pearson相关系数评估同一结构内（25 ms bin）和不同结构间（50 ms bin）神经元对的同步放电活动。
6. 6.
   电刺激实验：在中线丘脑植入刺激电极，使用6 Hz低频刺激诱导SWD，使用100 Hz高频刺激终止SWD，评估刺激频率和电流幅度对SWD的影响。

四、研究结果

神经元在SWD期间的放电活动

研究人员首先量化了SWD期间的单单元放电率。结果显示不同核团的反应谱存在差异：某些核团（如VPM）的神经元放电率在SWD期间降低，而其他核团（如LP）的放电率则升高。总体而言，大多数结构中神经元在SWD期间的平均放电率相对于非发作期仅略有降低。z评分热图分析显示，大多数神经元在SWD期间的放电变化不显著，但少数亚群的放电率升高（如MD）。在C3H/HeJ小鼠中，持续升高的放电主要见于推定兴奋性单元，包括CL（13/63单元，21%）、LP（11/51单元，22%）和CA3（15/97单元，15%）。在Stargazer小鼠中，符合持续升高放电标准的单元较少。此外，在大多数结构中，SWD期间的神经元放电并未明显偏向爆发模式，仅在少数结构（如CA1、VPL、VPM、PO）中观察到爆发放电比例的轻微增加。

SWD期间神经元群体放电的振荡活动

尖峰-场相干性（SFC）分析显示，大多数记录脑结构中的神经元群体在SWD期间产生5-6 Hz范围的振荡活动，与该频率范围内SWD的主导频率一致。在少数脑结构（如CL、MD、LD）中，神经元倾向于与SWD周期同步放电，但也在此主导振荡周期之外放电，导致相位锁定较弱，峰值相干性出现在1-2 Hz范围。ESA分析进一步证实，PO、VPL、CL和MD等丘脑核团在SWD期间表现出最高的神经元节律性增加。

SWD前、中、后的放电时空图谱

相位分析揭示了SWD期间清晰的动作电位放电时间序列。在SWD进行中的负向ECoG尖峰之前，多个结构（包括VPM、LD和海马CA3）出现同步神经元活动，且这些结构先于S1活动。基底神经节（BG）和尾壳核（CP）的神经元在C3H/HeJ小鼠的SWD期间未表现出相位锁定。RT核团的活动主要发生在负向SWD尖峰之后、波形成分期间。在大多数结构中，推定兴奋性单元倾向于比推定抑制性单元提前一小部分SWD周期放电。

值得注意的是，C3H/HeJ小鼠中约三分之一的记录脑结构在SWD开始前即包含节律性尖峰活动。在SWD前产生节律性活动的结构在SWD后也产生节律性活动。SWD领先结构中的节律性单单元活动与局部LFP或皮层ECoG中的显著信号无关，表明LFP并不总是SWD领先结构中局部组织化尖峰活动的可靠指标。Stargazer小鼠的相位分析显示与C3H/HeJ小鼠存在若干相似之处，但峰值神经元放电发生在SWD周期内的略微不同时期，偏移不超过0.2相位单位（约40 ms）。

SWD期间的神经元同步性

研究人员通过计算神经元对尖峰序列的Pearson相关系数评估神经元同步性。结果显示，SWD期间大多数同一结构内神经元对的同步性增加，但增加程度因核团而异。丘脑核团在C3H/HeJ和Stargazer小鼠中均表现出最大的结构内同步性增加。

结构间相关性分析显示，SWD期间所有脑结构对的配对相关活动均增加，但CA3与外侧缰核（LH）之间（平均=0.28）以及CL与内侧缰核（MH）之间（平均=0.27）的增加最为显著。丘脑结构——尤其是中线丘脑——总体上表现出最大的相关活动增加。在两种小鼠模型中，外侧（LD、VPM）和中线（PO、CL、MD）丘脑结构以及齿状回（DG）均被分类为高相关结构。

度中心性分析将MD丘脑确定为SWD期间的常见同步枢纽，该核团在两种小鼠模型中均与至少两个脑结构表现出高度相关活动。

中线丘脑对SWD的频率依赖性调节

鉴于自发SWD以节律性低频活动为特征，研究人员假设在中线丘脑中施加此类活动将促进SWD产生。6 Hz（自发SWD的主导频率）的1秒刺激可靠地诱导了两种小鼠模型中的自持SWD，且诱导概率随刺激电流幅度增加而增加。然而，SWD诱导在Stargazer小鼠中效果较差，可能反映了该模型较高的基线SWD负担和不应期限制。

相反，100 Hz的1秒高频刺激快速终止了正在进行的SWD，且呈电流幅度依赖性效应。这种效应在Stargazer小鼠中尤为有效。这些结果表明，低频节律性刺激通常促进SWD产生，而高频刺激通常抑制正在进行的SWD。然而，C3H/HeJ小鼠比Stargazer小鼠更易产生刺激诱发的SWD，而Stargazer小鼠对刺激诱导的SWD终止比C3H/HeJ小鼠更敏感。

五、讨论与结论

本研究通过无偏方法调查了两种失神癫痫小鼠模型中的26个脑结构，结果与近期大鼠研究一致，表明SWD与体感皮层（S1）和腹基底丘脑复合体（VB）中神经元活动的微妙普遍降低相关。然而，神经元同步化是SWD远比放电率变化更突出的特征，绝大多数结构表现出与SWD负向ECoG尖峰的某种程度的相干性和相位锁定。大多数结构在SWD期间也表现出增加的相关尖峰活动。

关于经典丘脑皮层网络，本研究结果对皮层焦点理论提出质疑。研究人员发现S1在棘波周期内落后于其他脑结构，这与皮层输入为SWD期间丘脑活动提供必要驱动的假设不一致。此外，尽管T通道介导的爆发放电可能对SWD产生至关重要，但这种放电模式似乎代表皮层神经元的常见活动模式，可能并非SWD特有。

关于非经典结构对SWD的贡献，研究结果支持早期先驱提出的中线丘脑结构作为SWD关键启动器的假说。研究人员证明：（1）这些结构中的单个神经元在SWD前和SWD期间被招募；（2）以天然SWD频率刺激这些结构足以启动SWD；（3）以高频刺激这些结构可消除SWD。这些结果强调了中线丘脑结构在SWD动态中的潜在重要性。

关于癫痫中的神经回路简并性，研究人员观察到C3H/HeJ和Stargazer小鼠虽然产生电图相似的SWD，但其跨结构的单神经元时空动态不同，这为高度相似的癫痫发作源于不同回路级机制提供了有力证据。这一发现为癫痫治疗提供了新视角：当存在多种SWD解决方案时，针对特定细胞或回路元件的精确靶向可能效果有限。然而，针对常见的、模型无关的回路元件——如本研究鉴定的高功能连接性丘脑结构——可能支持更普遍的失神癫痫治疗，尽管疗效可能有所差异。

研究存在一些局限性。C3H/HeJ小鼠表现出视网膜变性和失明，而Stargazer小鼠表现出小脑功能障碍和共济失调，这些表型通常与儿童失神癫痫无关。此外，细胞外硅探针记录仅采样每个记录脑区内的一部分神经元，稀疏放电、低幅度细胞外波形或探针覆盖有限的神经元群体可能未被充分代表。电刺激实验证明扰动特定脑区活动可触发或终止SWD，但并未单独确立受刺激结构是SWD产生的唯一负责者，刺激参数可能与解剖靶标同样重要。

综上所述，本研究提供了关于SWD产生的新视角：神经元同步化的变化——而非放电率——是SWD的关键标志；SWD期间招募的神经回路广泛，包括若干报道不足的丘脑和海马结构；SWD网络表现出简并性，C3H/HeJ和Stargazer小鼠尽管产生电图相似的SWD，但其跨结构的单神经元时空动态不同。