《iScience》：Species-specific inflammatory responses of chondrocytes: Toward evidence-based model selection in OA research
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为了为基于证据的骨关节炎（osteoarthritis，OA）模型选择提供依据，本研究比较了六种物种（人、马、羊、兔、大鼠和小鼠）的关节软骨细胞（chondrocytes）在标准化白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tu
为了为基于证据的骨关节炎（osteoarthritis，OA）模型选择提供依据，本研究比较了六种物种（人、马、羊、兔、大鼠和小鼠）的关节软骨细胞（chondrocytes）在标准化白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激下、于二维（2D）和三维（3D）培养中的炎症反应。研究人员通过实时定量PCR（RT-qPCR）和3′RNA测序（3′RNA sequencing）评估了软骨细胞的活力、增殖、伤口愈合和转录组变化。在形态、增殖和炎症基因激活方面观察到显著的种间差异，仅有两个基因（SOD2、NFKBIA）在所有物种中保守。人、马和大鼠软骨细胞共享包括急性期反应、去泛素化和A类/1-G蛋白偶联受体（class-A/1-GPCR）信号在内的通路。物种特异性反应包括马的基质重塑、羊的类风湿关节炎相关通路以及大鼠的混合炎症-再生特征。虽然没有任何物种完全复制人OA，但马和大鼠软骨细胞最能反映人炎症的关键方面。这些发现强调了模型选择中分子标准的必要性，并主张当种间差异限制动物模型的转化价值时，采用基于人细胞的模型。
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种异质性疾病，包含不同临床表型和内型（endotype），但炎症是各分子亚型OA发病机制的关键驱动因素。促炎细胞因子在骨关节炎关节中持续上调，通过促进分解代谢、抑制组织修复并改变软骨细胞（chondrocytes）表型和功能，参与软骨退变、软骨下骨重塑和滑膜炎症。其中，白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是OA相关炎症的核心介质，激活核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）并诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、IL-6等，同时抑制聚集蛋白聚糖和2型胶原等细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分合成。IL-1β和TNF-α刺激广泛用于在体外和体内模拟OA相关炎症，但仍无疾病修饰性骨关节炎药物（disease-modifying osteoarthritis drugs，DMOADs）成功转化。临床前动物模型预测价值有限，超过90%的OA疗法在临床试验失败，主要因缺乏疗效或安全性问题，且可重复性差。动物模型常优先考虑成本、动物大小、操作便利、诱导速度和基因修饰可行性，而非与人类疾病的机制保真度，因此多表现为表型模拟而不能准确模拟自然OA发病和进展的分子细胞过程。不同物种间软骨细胞炎症反应的分子差异尚未在常用动物模型中与人类直接系统比较。因此，研究人员假设IL-1β和TNF-α驱动的软骨细胞关键炎症和分解代谢通路转录激活具有种特异性，影响其作为人OA转化模型的适用性，并开展跨物种比较，以识别更合适模型，支持替代、减少和细化（3R）原则。
研究人员比较了六种物种（人、马、羊、兔、大鼠和小鼠）的关节软骨细胞在标准化IL-1β和TNF-α刺激下，于2D和3D培养中的反应。结论是显著种间差异存在于形态、增殖、基因表达和转录组谱；没有任何单一动物模型完全复制人OA的多方面炎症谱；马和大鼠软骨细胞最能反映人炎症关键方面；研究强调基于分子内型而非仅表型的模型选择，并主张在种间差异限制转化价值时使用人细胞模型。
关键技术与样本来源：研究人员纳入六个物种，每物种n=3女性中年供体：人52–58岁、马11–19岁、羊2–5岁、兔5–6月、大鼠5–6月、小鼠2–4月（C57BL/6）。人关节软骨来自全膝关节置换术患者，经维也纳医科大学伦理委员会批准并来自ViBiMeD Biobank；马、羊、兔、大鼠和小鼠组织在维也纳兽医大学因无关原因安乐死后取材，符合机构规范。获取原代软骨细胞后，在2D和3D培养中接受标准化IL-1β/TNF-α刺激。主要方法包括Phalloidin/DAPI形态分析、MTT活力、Caspase-3/7凋亡、IncuCyte增殖和划痕愈合、RT-qPCR、3
′RNA测序、Ingenuity通路分析（IPA）及Spearman相关验证。
研究结果：
形态学（Morphology）：Phalloidin/DAPI染色显示软骨细胞形态种间差异显著，总细胞大小、核大小、胞质大小、核/胞质比和圆形度差异（p<0.0001）。马软骨细胞显著更小更紧凑，小鼠最大；人细胞显著小于小鼠但大于马，核和胞质小于小鼠但大于羊和马，人核/胞质比低于马和羊，圆形度低于大鼠。
小鼠软骨细胞凋亡（Murine chondrocyte apoptosis）：小鼠软骨细胞显示传代诱导凋亡，Caspase 3/7活性增加，因此排除后续实验。
炎症剂量滴定与细胞活力（Inflammation dose titration and cell viability）：RT-qPCR显示IL-6和MMP1诱导阈值种特异。人和羊在1 ng/mL IL-1β和TNF-α显著上调MMP1，兔和大鼠≥2.5 ng/mL，马≥5 ng/mL；IL-6在人、羊和兔2.5 ng/mL显著增加，大鼠和马需≥5 ng/mL。5和10 ng/mL下所有物种IL-6和MMP1显著上调。10 ng/mL使人软骨细胞代谢活性明显增加，但显著降低羊软骨细胞代谢活性，因此选用5 ng/mL进行后续标准化刺激。
增殖测定（Proliferation assay）：软骨细胞增殖率种间差异显著，健康与炎症条件下均明显。马增殖最快，兔和人最慢。健康时兔显著慢于马和羊；炎症时兔仍显著慢于马和羊，炎症马显著快于人。炎症刺激在多数物种未改变增殖，但马炎症后细胞生长显著增加。
伤口愈合划痕试验（Wound healing scratch assay）：伤口闭合率在物种间无显著差异，健康与炎症软骨细胞间也无显著差异，唯一例外是兔软骨细胞在炎症时伤口闭合显著加快。
炎症软骨细胞跨物种比较转录组分析：NGS（Comparative transcriptomic analysis of inflamed chondrocytes across species: NGS）：5 ng/mL刺激后RNA测序鉴定人463、马72、羊152、大鼠65个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）；兔无显著DEGs，排除后续Venn图和IPA分析。仅SOD2和NFKBIA在所有四个物种中一致差异表达。羊与人共享DEG最多（31/152，20.4%），其次马（26/72，36.1%）和大鼠（23/65，35.4%）。六个基因（BIRC3、MMP1、MMP13、FTH1、PDGFRA、AEBP1）在人、马和羊中上调；人-大鼠重叠包括IL6、MMP3、MMP9、CXCL3、HMOX1、MT2A、COMP、PRG4、COL1A2和CCN2。IPA显示人调控86条经典通路（|z|≥2），大鼠10条、马9条、羊5条；仅三条通路由人、马和大鼠共享：A类/1（视紫红质样受体）、去泛素化和急性期反应信号。物种特异通路：人核心炎症驱动因子为IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-17A、IFN-γ和TNF，涉及OA通路及肝纤维化/肝星状细胞活化；马也有IL-1α、IL-1β、IFN-γ和TNF，涉及肝纤维化/肝星状细胞活化及粒细胞黏附和渗出；羊主要通过类风湿关节炎相关通路反应；大鼠显示急性和再生混合反应，关键通路包括急性期反应和血肿消退信号，中心细胞因子包括IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF，以及转录因子RELA。
NGS数据的定量PCR正交验证（Orthogonal validation of NGS data by quantitative PCR）：IL6、MMP1、MMP13、SOD2、TXNRD1、COL2A1、ACAN和PRG4表达方向与幅度同RNA-seq高度一致（Spearman’s ρ=0.871，p<0.0001）。物种、条件（天然组织 vs 健康3D vs 炎症3D）及其交互均显著影响这些基因。天然人软骨中COL2A1低于兔和大鼠但高于马，ACAN低于所有三种动物；人天然IL-6高于马，TXNRD1高于马和羊，MMP1高于羊，MMP13高于大鼠。转为3D培养后，IL-6在人、马不变，羊、大鼠显著下降，兔轻度升高；ACAN在所有物种下降，COL2A1除马外均下降。炎症刺激下，除兔外所有物种IL-6显著上调；MMP1除兔外、MMP13除大鼠外均诱导。炎症3D人软骨细胞IL-6和MMP1水平最高；马MMP13显著上调；炎症羊软骨细胞COL2A1和PRG4显著低于人，炎症大鼠ACAN高于人。
讨论指出，该研究全面比较常用OA动物模型与人软骨细胞在标准化IL-1β和TNF-α刺激下的炎症反应，发现形态、活力、增殖、基因表达和转录组谱存在显著种间差异，强调模型选择需考虑物种特异性并遵循3R原则。小鼠软骨细胞因易受酶消化影响、传代后凋亡被排除；成年小鼠关节软骨细胞难培养、产量低、增殖有限、单层培养快速去分化，常用幼龄供体不能反映OA相关老龄细胞群，因此其体外脆弱性限制模型保真度评估。人重组细胞因子的使用基于标准化炎性刺激和与既有文献可比性；人IL-1β和TNF-α与纳入物种序列同源性较高，BLAST显示IL-1β与人同源性60%（羊）至74%（兔），TNF-α为78%（大鼠）至87%（马），提示交叉反应。种特异反应可能更多受物种特异受体库、受体脱落和胞内接头使用影响。跨物种基因表达和转录组分析显示，有限qPCR标志物的表面相似可掩盖通路层面差异；基因水平一致不等于调控网络或通路动态保守，基因水平不一致也不必然等同功能分歧。RNA-seq发现人DEGs最多，仅SOD2和NFKBIA共有；IL-1-NF-κB-MMP轴和氧化应激反应为保守核心。尽管有共享通路，关键分歧仍存在，如人软骨细胞强激活中性粒细胞胞外诱捕网信号和IL-1家族信号，马激活NF-κB信号，OA通路在人、马和羊激活而大鼠未激活。研究认为没有单一动物模型完美模拟人OA复杂分子景观，需谨慎选模和物种特异研究；这些发现对转化医学和兽医均有意义。限制包括人软骨来自关节置换可能非完全健康、部分物种NGS注释不完整、仅纳入女性样本，因此未评估性别影响。
研究结论部分翻译：总之，炎症机制是多种OA内型发病机制的核心。因此，动物模型的炎症反应必须紧密模拟人类，才能真正适合OA研究和治疗开发。本研究强调软骨细胞炎症反应的复杂性和物种特异性。没有任何单一动物模型完全再现人OA的多方面炎症谱。随着OA治疗日益精确和机制靶向，将动物数据直接外推到人类的局限性变得越来越明显和重要。为提高临床前疗效并减少转化失败，需要向更具策略性和基于证据的动物模型选择转变，由转录组和功能保真度而非仅结构相似性指导。跨物种转录组分析的整合为基准化动物模型的转化相关性并识别分子谱最接近人类疾病生物学的物种提供了有力工具。在跨物种模拟缺乏或不足时，人3D体外模型可能为研究特定机制提供最可靠且伦理上合理的方法。这些策略共同可增强模型有效性，坚持3R原则，并最终加速针对人类和兽医患者有效、靶向OA疗法的开发。
