《Cancer Management and Research》：Development of a Multiplex PCR to Detect the BCR-ABL1 Transcripts in Chronic Myeloid Leukaemia Patients in Indonesia
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背景 目前可用于鉴定慢性髓性白血病（CML）患者BCR-ABL1基因融合转录本的商业化试剂盒有限。多数试剂盒基于RT-PCR检测e14a2和e13a2转录本作为主要断点片段，但不检测次要转录本。因此，本研究旨在开发一种用于BCR-ABL基因转录本的多重PCR方
背景 目前可用于鉴定慢性髓性白血病（CML）患者BCR-ABL1基因融合转录本的商业化试剂盒有限。多数试剂盒基于RT-PCR检测e14a2和e13a2转录本作为主要断点片段，但不检测次要转录本。因此，本研究旨在开发一种用于BCR-ABL基因转录本的多重PCR方法。方法 设计引物以扩增来自52例CML患者存档mRNA逆转录所得cDNA中的四种BCR-ABL1转录本。通过多重PCR鉴定BCR-ABL1转录本，并将该检测性能与Xpert? BCR-ABL Ultra（GeneXpert）进行比较。结果 多重TD-PCR成功扩增四种BCR-ABL1转录本，e13a2和e14a2的检测限为10 fg/μL，e1a2和e19a2为100 fg/μL。在52份存档RNA样本中，40份确认为阳性。最常见转录本为e14a2，在确认阳性样本中占72.5%，其次为e13a2，占25%。e19a2转录本在阳性样本中占2.5%。无患者表达e1a2转录本类型或共表达e14a2和e13a2。与GeneXpert结果相比，多重PCR的总体灵敏度和特异性分别为97.56%（95% CI：87.14–99.94%）和100%（95% CI：71.51–100%）。结论 所开发的可鉴定四种BCR-ABL1转录本的多重PCR检测可用于CML诊断环境。关键词：慢性髓性白血病；多重聚合酶链反应；BCR ABL转录本。
慢性髓性白血病（chronic myeloid leukaemia, CML）是一种多能造血干细胞恶性克隆性疾病，主要由费城染色体t(9,22)(q34;q11)及BCR-ABL1融合基因引起。年发病率约为1–2例/100,000人。BCR-ABL1融合基因由BCR和ABL1基因断点形成，产生持续激活酪氨酸激酶的蛋白，导致粒细胞不受控增殖。根据BCR-ABL1转录本类型，CML可分为主要BCR（M-bcr）、次要BCR（m-bcr）和微小BCR（μ-bcr）。超过95%的CML患者具有M-bcr型，包括e13a2和e14a2，二者相差75 bp或25个氨基酸；m-bcr转录本为e1a2；μ-bcr转录本为e19a2。上述转录本分别合成p210、p190和p230异常融合蛋白。CML诊断涉及临床和实验室检查，包括体检、全血细胞计数及分类、血涂片、骨髓细胞遗传学、荧光原位杂交（FISH）以及定性逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测BCR-ABL1转录本。欧洲LeukemiaNet（ELN）和印度尼西亚指南要求检测BCR-ABL1转录本类型。诊断时准确鉴定BCR-ABL1转录本类型具有临床重要性，因为不同转录本可能与不同临床特征相关，并可影响分子监测策略和治疗反应解释。
目前存在的问题是，在高收入国家，可识别主要BCR-ABL1转录本类型的商业化定性RT-PCR试剂盒广泛可用并常规使用；但在印度尼西亚，这些试剂盒未注册、不定期库存或对许多实验室过于昂贵。因此，在印度尼西亚环境中，缺乏稳健、本地验证、可负担且能同时检测主要BCR-ABL1转录本变体的检测方法，是实施现行ELN和国家指南的实际障碍。为此，研究人员旨在开发多重touchdown PCR方法，用于诊断和表征四种最相关BCR-ABL1转录本类型（e13a2、e14a2、e1a2和e19a2）。通过单反应中多引物组扩增多个靶序列，所提出的多重PCR方法拟减少周转时间、降低试剂和耗材成本、减少手工时间和污染风险，并在仅有标准PCR设备的印度尼西亚常规分子实验室提供全面转录本分型，填补当前诊断缺口，支持指南一致性护理。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究经Universitas Padjadjaran大学伦理委员会批准（No 1396/UN6.KEP/EC/2022），使用CML患者存档RNA样本。采用Primer3设计引物，靶向BCR内参及e13a2、e14a2、e1a2、e19a2；以gBlocks?基因片段作为cDNA模板，从单重PCR开始优化至双重、三重和四重PCR。使用52份CML患者存档RNA样本（2022年1月至2024年8月收集，?80°C保存），与Xpert? BCR-ABL Ultra（GeneXpert）结果比较。统计采用2×2列联表评估灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和总体诊断准确性。
研究结果如下。Multiplex Touchdown PCR Development：单重PCR结果显示，e13a2产生381 bp条带，e14a2产生456 bp条带，e1a2和e19a2分别产生693 bp和585 bp条带，与in silico引物设计软件预测一致。Sanger测序确认每个扩增子断点序列正确。双重、三重和四重PCR结果均显示所有优化PCR产生各断点的预期条带大小。检测限（LoD）通过阳性对照系列稀释评估，e13a2和e14a2的灵敏度为10 fg/μL，e1a2和e19a2的灵敏度为100 fg/μL。Characterisation of the BCR-ABL1 Transcripts in CML Patient Samples：所开发的多重Touchdown PCR用于鉴定52份CML患者存档mRNA样本中的BCR-ABL1转录本。多重PCR显示最常见转录本为e14a2（72.5%），其次为e13a2（25%），仅1例CML患者鉴定为e19a2（2.5%）。无患者表达e1a2转录本类型，也无患者共表达e14a2和e13a2。与GeneXpert结果比较，多重BCR-ABL1的总体灵敏度和特异性分别为97.56%（95% CI：87.14–99.94%）和100%（95% CI：71.51–100%），总体一致性为98.08%。在52份存档RNA样本中，仅1例结果不一致，即GeneXpert阳性而多重TD-PCR阴性；该样本来自治疗中患者，BCR-ABL1转录本水平极低（国际标准[IS]<0.3%），不一致最可能归因于Xpert assay对低丰度转录本具有更高分析灵敏度。这些发现表明，所开发的多重TD-PCR适用于诊断时BCR-ABL1转录本类型的定性鉴定，但不适用于微小残留病（MRD）的检测或监测，后者需要高灵敏度定量分子检测。
讨论部分总结如下。印度尼西亚常用BCR-ABL商业化试剂盒为定量RT-PCR试剂盒，仅检测和定量两种最常见转录本e13a2和e14a2，不能确定具体转录本。研究人员开发了多重RT-PCR，使用三个BCR引物和一个ABL引物检测多种BCR-ABL转录本，并以BCR转录本作为内参。多重RT-PCR在单反应中使用多引物组检测和扩增多个靶基因或转录本，因此可作为识别CML患者BCR-ABL转录本的重要诊断工具。该多重Touchdown PCR高度灵敏，可检测低至100 fg/μL的四种转录本。BCR-ABL1转录本类型对预测治疗结果和无治疗缓解率重要。e1a2转录本主要见于淋巴母细胞急变期CML和急性淋巴细胞白血病，在慢性期CML中发生率约1.8%。有限研究提示，m-bcr可能与单核细胞增多和更具侵袭性疾病相关；在淋巴或混合系急变中，e1a2是高危情况，对酪氨酸激酶抑制反应差。罕见e19a2融合转录本通常见于伴显著中性粒细胞成熟的慢性髓性白血病，一些研究人员也将其称为慢性中性粒细胞白血病。e19a2融合基因最初与中性粒细胞性CML相关，后者为轻度Ph-骨髓增殖性疾病，进展相对不常见，但后来在经典CML和急性髓系白血病中也检测到e19a2融合基因转录本。然而，已有研究显示e19a2型CML在克隆演化和急变期染色体异常方面与M-BCR无显著差异。本研究中约四分之一患者表达e13a2转录本，最常见为e14a2，一例患者发现罕见e19a2。本研究中印度尼西亚患者无e13a2/e14a2共表达和e1a2转录本类型，可能与种族差异或检测方法灵敏度有关。这些发现与印度尼西亚日惹的一项研究相似，即e14a2转录本比例高于e13a2；但少数研究报道相反结果。一项包含34项研究、54,034例患者的综述显示，e14a2总体估计患病率高于e13a2（分别为54%和39%）。本研究中男性患者（55%）倾向于表达e14a2，与既往报道性别与转录本类型关系相反，即男性患者更倾向表达e13a2，女性更倾向表达e14a2。鉴于本研究样本量小，应谨慎解释该队列中BCR-ABL1融合分布，因为其可能不能反映印度尼西亚更广泛CML患者的BCR-ABL1融合谱。本研究旨在作为新多重PCR检测的概念验证和初步临床验证，而非提供结论性分子流行病学数据。因此，有必要开展更大规模、多中心、涵盖更广泛患者人群的研究，以全面确定印度尼西亚BCR-ABL1融合转录本的分子流行病学，并进一步确认该检测的临床效能。与GeneXpert结果比较，所开发的多重Touchdown PCR表现出高总体一致性；仅一例不一致，该样本来自治疗中患者，BCR-ABL1转录本水平极低（IS<0.3%），不一致最可能归因于Xpert assay对低丰度转录本具有更高分析灵敏度。这些发现表明，所开发的多重TD-PCR适用于诊断时BCR-ABL1转录本类型的定性鉴定，但不用于MRD检测或监测，后者需要高灵敏度定量分子检测。研究结论翻译：所开发的多重Touchdown PCR是鉴定BCR-ABL1转录本类型的可靠方法，因此可作为CML患者有用的诊断工具。
