限制细胞内钙蓄积可缓解成纤维细胞衰老和肺纤维化

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Limiting the intracellular calcium accumulation alleviates fibroblast senescence and pulmonary fibrosis

　　

摘要

特定钙调节因子的激活及其下游细胞内钙信号通路已被确立为细胞衰老的标志性特征。然而，细胞衰老和年龄相关疾病过程中细胞内游离钙浓度的变化及其功能后果仍未完全阐明，在成纤维细胞中尤其如此。在本研究中，我们测量了衰老过程中细胞内钙水平，并观察到显著升高。随后，对衰老刺激诱导的细胞内钙积聚进行螯合，不仅有效延缓了钙水平升高，还延缓了活性氧（ROS）积累、DNA损伤以及成纤维细胞衰老。体内实验表明，腹腔注射钙螯合剂BAPTA-AM（BAPTA）显著减轻了肺纤维化表型，表现为体重下降减轻、炎性细胞浸润减少、胶原沉积减少以及纤维化和衰老标志物表达降低。值得注意的是，纤维化肺组织的转录组分析显示，BAPTA处理显著抑制了衰老相关分泌表型（SASP）。总体而言，我们的发现表明，限制衰老刺激引发的细胞内钙积聚可减轻成纤维细胞衰老并改善肺纤维化，从而突显了钙螯合剂在年龄相关病理中的治疗潜力。

引言

细胞衰老以不可逆的细胞周期停滞为特征，并伴随明显的形态学变化和衰老相关分泌表型（SASP），在全球人口老龄化的背景下日益引起科学界的关注[1]。细胞衰老主要由端粒缩短以及各种外源刺激诱导，包括氧化应激、DNA损伤、线粒体功能障碍、癌基因激活等[2]。衰老细胞通常以细胞周期抑制因子的表达升高、DNA损伤灶的积累、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加、SASP因子分泌增强以及增殖标志物表达降低而被鉴定[3]。许多研究表明，成纤维细胞衰老在衰老及年龄相关疾病中发挥重要作用[4]。衰老的成纤维细胞分泌多种SASP因子，包括炎症因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶，通过旁分泌信号将衰老相关表型传递给邻近细胞，从而参与组织衰老的发生和进展[4]。此外，衰老的成纤维细胞还会驱动细胞外基质的组成和结构改变，最终损害组织的结构完整性和功能能力[5]。

以肺纤维化（PF）为例，它是一种典型的年龄相关病理，70岁以上人群中PF的发生率是40–69岁人群的6.9倍[6]。此外，已有研究表明，主要由衰老的肺成纤维细胞分泌的SASP因子会触发成纤维细胞灶的出现、胶原紊乱、细胞外基质过度沉积，进而导致正常肺结构和功能的丧失，最终导致PF的发生[7]。因此，从成纤维细胞衰老的角度研究PF的发病机制，可能为临床管理揭示新的潜在治疗途径。

细胞内游离钙作为最重要的细胞内第二信使之一，通过其精确协调的时空动态变化，在调控细胞增殖、分化、自噬和凋亡方面发挥重要作用[8]。值得注意的是，越来越多的证据表明，细胞内钙信号失调以及钙相关调节因子的异常表达或活性与细胞衰老、机体老化及年龄相关疾病密切相关[9]。具体而言，钙离子通过钙通道从细胞外或内质网（ER）流入细胞，随后激活包括线粒体功能障碍、活性氧（ROS）积累、DNA损伤和SASP分泌在内的衰老调控通路[10]。然而，由于众多钙通道之间存在功能冗余，选择性地抑制一种或少数钙通道不足以有效干预细胞衰老或年龄相关疾病。因此，我们提出疑问：螯合细胞内钙离子是否有助于减轻成纤维细胞衰老和PF。

在本研究中，我们首先评估了经衰老刺激处理的成纤维细胞中的细胞内钙水平。随后，我们使用一种细胞通透性、高度选择性的钙螯合剂BAPTA-AM（BAPTA）[11]来螯合细胞内游离钙，并在体外和体内全面评估了钙限制对衰老成纤维细胞的功能后果。最后，我们通过转录组分析对钙螯合缓解PF的机制进行了初步研究。

章节摘要

衰老成纤维细胞中细胞内钙水平升高

为确定衰老的肺成纤维细胞中是否存在细胞内钙积聚，我们使用胞质钙指示剂Fluo4和线粒体钙探针Rhod2，通过流式细胞术检测衰老刺激后成纤维细胞的细胞内钙水平。结果表明，博来霉素（Bleo）和多柔比星（Dox）均诱导钙离子显著流入胞质（图1a）和线粒体（图1b）。此外，在类似情况下观察到类似的升高现象

讨论

在本研究中，我们证明成纤维细胞在衰老过程中细胞内钙水平升高。同时，对衰老成纤维细胞中细胞内钙进行螯合，有助于减轻ROS积累、缓解DNA损伤，并最终减弱细胞衰老。此外，体内结果表明，钙螯合剂BAPTA的给药减轻了某些PF表型，包括体重下降、炎性细胞浸润减少以及降低的

细胞培养、处理与染色

人肺成纤维细胞MRC5和小鼠胚胎成纤维细胞MEF购自中国科学院细胞库（通过STR方法鉴定），在无支原体条件下，使用含10%胎牛血清（FBS，Procell）、1%青霉素-链霉素（Solarbio）和低浓度Plasmocin?（Invivogen）的高糖DMEM培养基（Procell）进行培养。细胞在37 °C、5% CO?的标准培养箱中维持，每2–3天传代一次。治疗诱导的

CRediT作者贡献声明

许静怡： 论文撰写（原稿）、可视化、验证、软件、方法、调查研究、数据整理。杨敬辉： 可视化、软件、方法、调查研究、形式化分析、数据整理。孙文涛： 软件、方法、调查研究、形式化分析。史清桐： 方法、调查研究、形式化分析、数据整理。倪清文： 验证、软件、形式化分析、数据整理。陈菊萍： 可视化、验证、形式化分析、数据整理。

伦理批准

所有研究均经扬州大学附属医院科学技术委员会（2020-YKL03-G048）及扬州大学实验动物伦理委员会（202512061）批准。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究在江苏省卫生健康委员会科研项目（K2025003）以及扬州基础研究计划（联合专项）——健康养生类别（2024-2-17、2025-1-04）的支持下完成。

许静怡｜杨敬辉｜孙文涛｜史清桐｜倪清文｜陈菊萍｜阮长娇｜马星杰｜杨长松

扬州大学附属医院的重症监护实验室，中国扬州