PTSNtr 通过 ManX 非磷酸化状态与 HprK 调控 Rhizobium leguminosarum 中心碳代谢及碳储存聚合物积累

《Applied and Environmental Microbiology》：Regulation of central carbon metabolism and storage polymers by PTSNtr in Rhizobium leguminosarum

　　

细胞内碳和氮水平的协调对细菌最佳生长至关重要，并且在根瘤菌中，对土壤存活、根系定殖及与宿主植物的共生互作也至关重要。在此，研究人员表明，碳和氮代谢的全局调控因子——磷酸转移酶系统 PTS^Ntr（phosphotransferase system PTS^Ntr）调控 Rhizobium leguminosarum 中三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环活性以及三种主要碳储存聚合物的积累：糖原（glycogen）、聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）和胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）。效应蛋白 ManX 的非磷酸化形式足以完全激活 TCA 循环脱氢酶。因此，manX 缺失降低了脱氢酶活性，并将溢出的碳重新导向储存聚合物，表型模拟在氮饥饿下生长的野生型细胞。研究人员进一步证明，R. leguminosarum 的碳代谢还受到 HPr 激酶（HPr kinase, HprK）蛋白的严密调控。在 hprK 突变体中，NPr Ser48 磷酸化的丧失有利于通过组氨酰臂进行磷酸转移，并预测会增加下游 PTS^Ntr 组分的磷酸化。当在葡萄糖上生长时，hprK 突变体积累升高的胞内嘧啶水平，并表现出增加的苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, MDH）和 TCA 循环活性，与向糖异生转变的失调一致。该突变体还过量产生 EPS，这一效应可能由磷酸化 PtsN 与 ChvI/ChvG 双组分调控系统之间的串扰介导。总之，这些数据表明 HprK 对 PTS^Ntr 调控的过程发挥多效控制，影响中心代谢同时抑制 EPS 产生，可能通过促进 PtsN 的非磷酸化状态实现。

研究人员围绕 Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841（Rlv3841）及其 PTS^Ntr 相关突变体，探究 PTS^Ntr 如何协调中心碳代谢与碳储存。生物固氮（biological nitrogen fixation, BNF）依赖根瘤菌在不同生活史阶段维持碳氮平衡；PTS^Ntr 是 α-变形菌中与 Ntr/PII 并行的全局调控系统，通过 PtsP（EI^Ntr）、NPr（PtsO）、PtsN（EIIA^Ntr）和 ManX（EIIA^Man）的磷酸接力调控碳氮代谢。此前已知非磷酸化 ManX 对 TCA 循环完全激活必要，磷酸化 PtsN 参与 ATP 结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运和 ChvI/ChvG 依赖的 EPS 合成，HprK 可磷酸化 NPr 的保守 Ser 残基。然而，PTS^Ntr 与碳储存聚合物之间的联系机制不清，ManX 与中心代谢酶的直接互作也仅在少数物种中报道，在 R. leguminosarum 中尚缺乏系统证据。因此，研究人员结合酶活、聚合物定量、单细胞 Raman 光谱、氧消耗和 qPCR，分析 manX、hprK、ptsN 等突变体在氮充足和氮限制下的代谢表型。

方法概括：研究使用 Rlv3841 及其衍生突变体，在通用最小盐（UMS）培养基中，以 10 mM 葡萄糖或 20 mM 琥珀酸为碳源，10 mM 或 0.5 mM NH₄Cl 为氮源。关键方法包括 TCA 循环酶活测定、O₂ 消耗测定、lacZ 启动子活性测定、PHB/糖原/EPS 定量、单细胞 Raman 光谱、RNA 提取与实时 qPCR，以及 t 检验/ANOVA 统计。样本为实验室菌株，非临床队列。

结果：
ManX 调控 TCA 循环脱氢酶活性。通过测定野生型、manX 突变体和 manX*H9A 的酶活，发现柠檬酸合酶（citrate synthase, CS）和富马酸酶不变，丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase, PDH）降低约 40%，异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）降低约 17%，α-酮戊二酸脱氢酶（α-ketoglutarate dehydrogenase, α-KGDH）降低约 54%，MDH 降低约 40%；manX*H9A 的 MDH 活性恢复至野生型。细菌双杂交（bacterial two-hybrid, BACTH）未检测到 ManX 与 MDH 或 SucA 的直接互作，ManX 易聚集。结论是 ManX 的非磷酸化状态足以激活 TCA 脱氢酶，缺失时脱氢酶活性下降。
hprK 突变体显示氧化代谢降低。通过 O₂ 消耗测定，在氮充足且葡萄糖或琥珀酸为碳源时，hprK 突变体耗氧率低于野生型；氮限制下两者均低。
hprK 突变体中 MDH 活性增加。通过酶活和启动子活性测定，hprK 突变体 MDH 活性显著上调，α-KGDH 与野生型相同；mdh 和 sucA 启动子活性无显著变化，提示转录后调控。
PTS^Ntr 调控胞外和胞内聚合物含量。通过化学定量，氮限制下野生型积累 EPS、糖原和 PHB；氮充足下 manX 突变体积累 PHB、糖原和 EPS，manX*H9A 不积累；sucD 突变体 RU116 在氮充足下不积累糖原；ptsN1N2 的胞内聚合物不变但 EPS 降低，ptsN*H66D 增加 EPS，ptsN*H66A 降低 EPS；npr 互补实验支持 HprK 介导的 NPr Ser48 磷酸化抑制 His17 磷酸化并促进 EPS。hprK 突变体氮充足下积累 EPS 但不积累 PHB，氮限制葡萄糖下不积累 PHB，而琥珀酸下积累 PHB。
Raman 光谱揭示 PTS^Ntr 突变体中生物分子积累改变。单细胞 Raman 光谱显示，氮限制野生型积累 PHB 和糖原并降低酰胺和嘧啶；manX 突变体在氮充足下即积累糖原和 PHB，并降低酰胺和嘧啶，模拟氮限制野生型；hprK 突变体积累核苷酸但 PHB、糖原和酰胺水平低。
hprK 突变体中 pckR 及其靶基因的差异表达与糖酵解条件下糖异生偏好一致。qPCR 显示，葡萄糖生长时 hprK 突变体 pckA（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，PEPCK）和 fbaB（编码果糖-1,6-二磷酸醛缩酶，FBA）表达分别约升高 3.7 倍和 2 倍，zwf（编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，G6PD）略降，pgl（编码 6-磷酸葡糖酸内酯酶，6PGL）无显著变化；琥珀酸生长时 pckA 和 fbaB 与野生型相当，但两者在琥珀酸下高度诱导。pckR（PEP carboxykinase regulator）转录在葡萄糖下约降低 2 倍，琥珀酸下与野生型相似，提示 PckR 参与 hprK 突变引起的中心碳代谢失调。

讨论总结：PTS^Ntr 通过 ManX 和 PtsN 整合氮碳信号，调控 TCA 循环与储存聚合物分配。ManX 缺失造成 TCA 脱氢酶活性降低和碳溢流，模拟氮饥饿；PtsN 磷酸化促进 EPS，HprK 通过 NPr Ser48 磷酸化调节该分支。hprK 突变体偏向糖异生，MDH 活性、嘧啶和 EPS 升高，葡萄糖下 PHB 合成缺陷，琥珀酸下可积累 PHB，说明 HprK 多效调控下游 PTS^Ntr 输出。结论翻译：研究人员发现 PTS^Ntr 通过相互关联的代谢调控机制协调碳代谢和储存。核心是 ManX，其活性维持 TCA 循环脱氢酶功能。ManX 缺失破坏 TCA 循环碳流，导致所有测试的碳储存聚合物（糖原、PHB 和 EPS）积累，并在氮可用时模拟氮饥饿。虽然对胞内聚合物的调控效应似乎由 ManX 介导，PtsN 变体分析支持磷酸化 PtsN 促进 EPS 产生。这种调控平衡由 NPr 磷酸化和 HprK 控制，HprK 调节 PTS^Ntr 输出蛋白的磷酸化状态。hprK 突变体的代谢表型表明在糖生长期间偏向糖异生状态，证实由 ManX 和 PtsN 磷酸化增加驱动的复杂调控效应。总体而言，结果揭示了一个紧密整合的调控网络，连接中心代谢与碳储存。PTS^Ntr 调控失衡破坏这种协调，减慢 TCA 循环活性并驱动非典型碳聚合物积累。总之，这些发现强化了 PTS^Ntr 作为控制细菌代谢平衡的中心调控网络的作用。