多物种生物膜中的社交互动与对 Listeria monocytogenes 的拮抗：生物膜与浮膜形成的群落决策

《Applied and Environmental Microbiology》：Welcome to the house-warming party: social interactions and antagonism against Listeria monocytogenes in multi-species biofilms

　　

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）整合入多物种生物膜（multi-species biofilms）并在食品加工设施中持续存在。其持续存在取决于微生物群落的组成，但哪些物种可容纳 L. monocytogenes、哪些不能，仍有待鉴定。此外，微生物群落中生物膜（biofilm）与浮膜（pellicle）形成的决策仍知之甚少。本研究旨在鉴定可容纳或不可容纳 Listeria 的群落，并观察多物种生物膜中的生物膜与浮膜形成。研究人员在六个重构群落（每个由5–19个菌株组成）中定量 L. monocytogenes。将一个15成员群落简化为五个物种，以定量这五个菌株所有31种组合中的 L. monocytogenes。Janthinobacterium tructae 偏好浮膜形成，而 Pseudomonas shahriarae 说服其他菌加入表面附着生物膜。在六个微生物群落中，当 Carnobacterium maltaromaticum 也存在时，L. monocytogenes 的细胞计数最低。分析五个菌株的所有组合时，证实了 C. maltaromaticum 的拮抗作用。C. maltaromaticum 的存在使 L. monocytogenes 细胞计数降低约1 log CFU/cm²。Serratia liquefaciens 也拮抗 L. monocytogenes，但仅在无 C. maltaromaticum 时观察到（P < 0.05）。群落基因组分析鉴定出接近100种不同的群体感应（quorum-sensing）系统，包括对 L. monocytogenes 也有杀细菌作用的肽。研究人员得出结论，用于描述人类社交互动的语言也适合描述多物种生物膜群落中的微生物相互作用，但阐明生物膜内嵌细菌之间的通信机制仍有待未来研究。重要性：与生物膜和浮膜形成以及是否容纳 L. monocytogenes 相关的微生物通信，部分与群体感应系统作为关键机制相汇聚。两种生物，Carnobacterium maltaromaticum 和 Serratia liquefaciens，拮抗 L. monocytogenes。微生物相互作用强烈依赖于微生物群落的复杂性，在由2、5或15个菌株形成的生物膜中观察到不同行为。本研究结果证明，保护性培养物的使用也可能减少食品加工设施中 Listeria 的持续存在，但远未提供对复杂细菌群落中通信和社会规则的理解。微生物相互作用的新视角可能指导未来实验。

研究背景方面，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要食源性病原体，其李斯特菌病死亡率高，且在易感人群中感染剂量低。自2000年以来李斯特菌病暴发增加，与即食食品需求增长有关。L. monocytogenes 尽管面对常规清洁和消毒，仍可在食品加工设施中持续存在。生物膜（biofilm）形成是长期微生物持久性的核心机制：生物膜基质使群落抵抗流体冲刷，并保护微生物免受环境胁迫和消毒剂影响。生物膜可由一种或多种细菌嵌入胞外聚合物基质形成，可在生物或非生物表面形成；浮膜（pellicle）则是气液界面形成的生物膜表型，使好氧菌获得氧气。食品加工设施生物膜群落可含10种以上细菌。种间相互作用决定生物膜或浮膜形成及生物膜形态。L. monocytogenes 并非所有菌株均形成单种生物膜，但可整合入多物种生物膜；其在食品加工设施中的出现与其他微生物呈正或负相关，但关联在不同商品和设施间不一致，且相关不等于因果。重构生物膜实验确认 L. monocytogenes 丰度受促进生存或施加竞争屏障的物种影响。然而，寡物种（少于10种）或多物种（10种及以上）生物膜中 L. monocytogenes 与其他微生物的相互作用仍了解有限，主要受实验设计复杂性限制；能促进或抑制 L. monocytogenes 的物种仍待鉴定，且多样细菌群落中生物膜与浮膜形成的决策很少被观察。因此，研究人员旨在确定多物种生物膜中有无 L. monocytogenes 时的种间相互作用及生物膜与浮膜形成。主要结论是：C. maltaromaticum 和 S. liquefaciens 可拮抗 L. monocytogenes；J. tructae 偏好浮膜，P. shahriarae 促使群落形成表面附着生物膜；群落复杂性影响微生物行为和生物膜表型；群体感应（quorum sensing，QS）可能是关键机制；保护性培养物可能减少食品加工设施中 Listeria 的持续存在。该研究提供了微生物相互作用的新视角，可指导未来实验。

为开展研究，作者采用两路实验设计。样本队列来源为六个细菌群落，分离自肉加工设施的同一隔离位点和同一采样时间。第一，将六个群落重构，每个含5–19个菌株，并加入12株 lineage I 和 II 的 L. monocytogenes 鸡尾酒，在不锈钢（stainless steel，SS）载体、LBNS 肉汤、10°C 下培养7天形成多物种生物膜。第二，将15成员 DLH 群落简化为五个物种，评估所有31个非冗余组合加 L. monocytogenes 的生物膜和浮膜形成。关键技术包括多物种生物膜培养、差异细胞计数、结晶紫生物量定量、剔除与逐步加入实验、群落 DNA 提取、lineage 特异性定量PCR（quantitative PCR，qPCR）、16S rRNA 基因扩增子 Nanopore 测序及统计分析。

结果部分，社区组成对生物膜生物量和浮膜形成的影响：研究人员使用来自 DLH 群落的五个物种，分析所有31个非冗余组合。所有细菌组合均形成生物膜，生物量范围为0.3–2.5 AU_{570 nm}，活细胞计数为6.7–8.6 log CFU/cm²。J. tructae 与 P. shahriarae 和 C. maltaromaticum 组合（JPC）及再加 Flavobacterium spp. FUA11107 的组合（FJPC）产生更高生物量。C. maltaromaticum 在含其组合中均高丰度；Flavobacterium spp. FUA11107 和 J. tructae 在多于两种菌的组合中较低；双种 FJ 组合中 J. tructae 多于 Flavobacterium spp. FUA11107；S. liquefaciens 在多数含 P. shahriarae、J. tructae 和/或 Flavobacterium spp. FUA11107 的群落中最丰富；P. shahriarae 在2–4种组合中高丰度，但 C. maltaromaticum 存在时下降。浮膜与生物膜决策受 J. tructae 和 P. shahriarae 影响：J、FJ、JS、JC、FJS、FJC、JSC、FJSC 组合形成浮膜；S. liquefaciens 与 J. tructae 存在时形成带气泡浮膜；C. maltaromaticum 与 J. tructae 存在时形成厚或薄浮膜；P. shahriarae 引入含 J. tructae 的群落（JP、JPC、FJPC、FJPSC）后形成生物膜而非浮膜；JPC 和 FJPC 在无 S. liquefaciens 时形成更厚底部生物膜。结论是群落组成是生物量关键因素，并改变浮膜与生物膜偏好。

L. monocytogenes 在六个多物种生物膜中的整合：将12株 lineage I 和 II 鸡尾酒加入六个多物种生物膜。生物量和总活细胞计数在群落间差异显著（P < 0.001）；生物量为0.4–1，SCB 最低，DLH 最高；总活细胞计数为7.7–8.5 log CFU/cm²。L. monocytogenes 活细胞计数在六群落间差异显著（P < 0.001），为4.3–6.8 log CFU/cm²，DDC 最低，D-ES1 最高。qPCR 显示群落组成（P < 0.001）、lineage（P < 0.001）及其交互作用（P < 0.05）影响 L. monocytogenes 丰度。多数群落中 lineage I 基因拷贝数高于 lineage II（P < 0.05）；DLH 中 lineage I 最高，为6.39 log gene copies/g，比同环境 lineage II 高1.8 log；DDC 中两 lineage 最低。差异细胞计数和16S rRNA 基因扩增子测序确认 Pseudomonas spp. 在所有群落中高丰度；C. maltaromaticum 存在于 SCB、D-ES1 和 P3M，且在这些群落中为最丰富成员之一，其存在与 L. monocytogenes 相对丰度降低相关。仅 DDC 群落观察到浮膜，浮膜群落组成与生物膜不同，不同 Pseudomonas 菌株在浮膜和生物膜中占优势或存在。结论是 L. monocytogenes 整合依赖细菌群落组成。

增加群落复杂性对浮膜形成的影响：将简化的五成员 DLH 群落与 L. monocytogenes 鸡尾酒组合，共32个组合，仅15个形成浮膜，其中11个为厚浮膜。含 J. tructae、P. shahriarae 或两者的组合一致形成浮膜。最终六物种生物膜群落未形成浮膜。逐步将剩余10个菌株成对加回：向六物种群落加入两个额外物种时，浮膜形成恢复；直到完整15成员群落重组时，无浮膜形成。结论是寡物种生物膜不能完全捕捉完整多物种群落的复杂性。

群落组成对 L. monocytogenes 细胞计数的影响：L. monocytogenes 的12株单独形成弱生物膜。其他31个生物膜总细胞计数为7–9 log CFU/cm²。L. monocytogenes 在多数组合中为次要组分。lineage I 和 II 相对丰度取决于群落组成；lineage II 仅在少数组合中更丰富（P < 0.05），其他至多五株组合中无差异。随着群落复杂性从5个核心成员增至15成员，lineage I 相对丰度增加，且在含7个或更多成员的群落中 lineage I 基因拷贝更丰富（P < 0.05）。L. monocytogenes 细胞计数在含 P. shahriarae 生物膜中最高，达7.59 ± 0.18 log CFU/cm²；含5或6个菌株的群落中为5.58 ± 0.05至6.52 ± 0.07 log CFU/cm²，较低端见于含 C. maltaromaticum 的组合。C. maltaromaticum 存在时，不论其他物种是否存在，均降低 L. monocytogenes 细胞计数（P < 0.05）；抑制最强在双种生物膜中，L. monocytogenes 仅2.71 ± 0.28 log CFU/cm²。在 C. maltaromaticum 与 L. monocytogenes 形成的生物膜中，lineage I 基因拷贝数比 lineage II 高两个 log cycles，表明差异抑制。比较各菌株存在与缺失：C. maltaromaticum 抑制 L. monocytogenes 活细胞计数（P < 0.05）；S. liquefaciens 也降低 L. monocytogenes 计数（P < 0.05），但仅在排除含 C. maltaromaticum 群落时显著；C. maltaromaticum 存在时 S. liquefaciens 无显著影响（P > 0.05）；Flavobacterium spp.、J. tructae 和 P. shahriarae 不影响 L. monocytogenes 活细胞计数（P > 0.05）。结论是 C. maltaromaticum 和 S. liquefaciens 可拮抗 L. monocytogenes，且 C. maltaromaticum 作用更强并受群落背景影响。

讨论部分总结：实验设计上，多物种细菌群落与其单个成员的生物膜和浮膜生态不同。研究采用（2ⁿ?1）组合方法评估五物种所有非冗余组合；15成员群落更接近食品加工环境，但需要32,767个组合，因此简化为五成员并尽量保留系统发育多样性。该简化基于 keystone species 假说，即群落功能和生物膜形成常由少数优势类群决定。结果识别出偏好气液界面浮膜的关键物种 J. tructae，以及促使形成生物膜的 P. shahriarae。简化限制在寡物种五成员与完整15成员 DLH 比较中显现：当 L. monocytogenes 存在时，群落复杂性增加可改变生物膜表型，从形成浮膜转为不形成浮膜，表明高阶相互作用随多样性出现。浮膜形成方面，浮膜是气液界面独特生物膜表型；J. tructae 偏好浮膜，与严格好氧菌最大化氧气可利用性一致。E. coli 中生物膜与浮膜转换由胞外基质（extracellular matrix，ECM）精细调节，种间相互作用经 QS 信号影响转变。多物种多 QS 系统形成“拔河”效应：P. shahriarae 形成表面生物膜，J. tructae 偏好浮膜，其他成员加入底部或顶部；P. shahriarae 与 J. tructae 协调后形成表面生物膜；C. maltaromaticum 加入 PJ 群落使通信更复杂动态，形成生物量更高但变异更大的表面生物膜；四物种群落也呈现高但可变的生物量，可能与 ECM 产生增加有关；四物种及以上时，更大更结构化的生物膜基质支持不同微生态位。L. monocytogenes 引入再次改变浮膜与表面生物膜平衡，反映兼性厌氧菌如 L. monocytogenes 和 C. maltaromaticum 与严格好氧菌如 J. tructae 和 P. shahriarae 之间的复杂通信，可能改变氧气和营养可利用性，驱动空间重组。QS 方面，15个菌株基因组编码90多个推定 QS 系统，包括 AI-1、autoinducing peptides、AI-2 和 AI-3；除 Pedobacter antarcticus 外，每个成员至少编码一个。Pseudomonas 菌株编码多个通过 QseB 系统的 AI-3 信号相关基因，Serratia 和 Carnobacterium 检测到 AI-2 相关信号；Carnobacterium 在革兰阳性菌中编码最多 QS 相关基因。该复杂性几乎排除了使用基因敲除突变体或 Transwell 系统进行靶向解析，QS 相关基因表达和 QS 分子鉴定仍有待未来多组学研究。L. monocytogenes 整合方面，lineage I 和 II 相对丰度模式在不同生物膜群落中不一致，提示 lineage 相关差异不是 L. monocytogenes 整合的主要决定因素。研究识别 C. maltaromaticum 和 S. liquefaciens 为拮抗 L. monocytogenes 的生物膜居民，分别约降低1和0.5 log CFU/cm²。单批实验中差异较小，但在工业生长—清洁—再生循环中可能放大，即使小竞争或抑制效应也会随时间增强。C. maltaromaticum 拮抗作用与有机酸及 class I 和 class II bacteriocins 产生有关，商业上用作 biopreservative 抑制即食食品中 L. monocytogenes；生物膜中 Carnobacterium 也表达 bacteriocin 相关基因。双种 CL 生物膜中 lineage II 基因拷贝数比 lineage I 低两个 log，表明 L. monocytogenes 对 bacteriocin 介导抑制的敏感性依赖 lineage。C. maltaromaticum 的竞争优势可能由 QS 增强；Carnobacterium 中 QS 相关基因表达可能通过种间 cross-talk 调节 L. monocytogenes；许多乳酸菌 bacteriocins 也作为 QS，拮抗与通信紧密相连；CS–CbnK–CbnR 系统控制 carnobacteriocin 和 immunity 基因的群体密度依赖表达；高 AI-2 或肽可干扰 L. monocytogenes 的主要 QS 回路 agr；乳酸菌产生分泌蛋白，可能具有 QS 抑制活性，从而抑制 L. monocytogenes 生长。

研究结论翻译：微生物通信与生物膜和浮膜形成以及是否容纳 Listeria 相关的内容，部分汇聚于群体感应系统作为关键机制。生物膜形成与 house-warming party 的类比部分成立：随着更多客人（细菌）到来，社交动态和聚会地点发生改变。这种复杂性进一步由传递友好（合作）和对抗（拮抗）内容的语言相互作用塑造。一种共同语言在全屋广泛协调，而外人无法理解的私人方言也被使用。本研究结果证明，保护性培养物的使用也可能减少食品加工设施中 Listeria 的持续存在。生物膜中微生物相互作用的新视角可能指导未来实验。目前，是时候喝一杯冷饮了，但研究人员仍有一个问题：前廊还是后廊？