Shewanella oneidensis中RyhB介导的血红素稳态调控在Fur调控细胞色素c合成中的作用

《Applied and Environmental Microbiology》：Effects of RyhB on Fur regulation of cytochrome c synthesis in Shewanella oneidensis

　　

Shewanella oneidensis 是最广泛研究的电化学活性细菌之一，因为其无与伦比的呼吸多样性，这在很大程度上建立于多样的细胞色素（cytochromes，cyts）c 之上。Fur（ferrous uptake regulator）已被牢固确立为通过调控铁稳态（iron homeostasis）对细胞色素 c 产生至关重要的因子，RyhB（small RNA）和 Hfq（RNA chaperone）亦然，但它们如何相互作用仍大部分未知。本研究中，研究人员展示 S. oneidensis RyhB 具有新特征，例如不寻常的长度以及与其 Escherichia coli 对应物而非其 Vibrio cholerae 对应物的功能可交换性。RyhB 缺失抑制由 Fur 缺失引起的标志性表型，包括 S. oneidensis 中生长受损和细胞色素 c 产生减少。尽管如此，对大多数细胞色素 c 基因表达的直接调控或对 Fur 缺失所致铁稳态破坏的抑制，似乎均非 RyhB 影响细胞色素 c 含量的主要机制。相反，该效应通过调节血红素（heme）水平实现；RyhB 介导血红素生物合成关键基因以及整个血红素摄取/降解系统的表达。总体而言，该研究强调了 RyhB 介导的转录后调控（post-transcriptional regulation）在 S. oneidensis 生理学中的重要性，揭示了 RyhB 影响细胞色素 c 生物合成的意外机制。
重要性：在细菌中，RyhB 已被牵涉于转录后调控多种生物过程。在 Shewanella oneidensis 中，Fur 和 RyhB 均影响细胞色素（cytochrome，cyt）c 含量，而细胞色素 c 是细菌呼吸多样性及其在生物能源和生物修复中潜在应用的基石。这里，研究人员展示，尽管 RyhB 通常与 Fur 表现出拮抗关系，但其具有新的序列特征，并差异性调控血红素生物合成和降解，导致细胞色素 c 含量改变。所呈现的数据表明，由 RyhB 调控的某一细菌中的生物过程高度复杂，相当于需要多种调控因子的协调，使细胞能及时响应环境变化。

研究背景方面，Shewanella oneidensis 是研究最深入的电化学活性细菌之一，其呼吸多样性主要依赖多种含铁蛋白，尤其是细胞色素 c（cytochrome c，cyt c）。细胞色素 c 是共价结合血红素（heme）的血红蛋白，参与胞外电子传递和/或氧化还原。S. oneidensis 编码超过 40 种不同的 cyt c，因此铁需求显著高于 Escherichia coli 等模式菌，必须严格调控铁稳态（iron homeostasis）。细菌中铁稳态由复杂调控网络控制。Fur（ferrous uptake regulator）在结合共阻遏物 Fe²⁺ 时结合 Fur box 并抑制转录；铁限制时 Fur 脱离 Fur box，使下游基因转录。RyhB（small RNA）和 RNA 伴侣 Hfq（RNA chaperone）参与转录后调控。在 S. oneidensis 中，Fur、RyhB 和 Hfq 均直接或间接影响 cyt c 含量，但三者如何互作尚不清楚。此前研究表明，fur 缺失导致铁稳态破坏，生长受损、细胞色素 c 含量显著降低；ryhB 缺失可升高 cyt c 含量；hfq 的作用报道不一致。因此，研究人员系统研究 RyhB 对 cyt c 含量的生理影响及其与 Fur 的互作，以揭示两者在铁稳态和细胞色素 c 生物合成中的关系。该研究具有重要意义，因为 cyt c 是 S. oneidensis 呼吸多样性和生物能源、生物修复应用潜力的核心。

研究人员开展的工作包括构建 ryhB 单缺失及与 fur、hfq 的双缺失，检测生长、细胞沉淀颜色、cyt c 和血红素水平，分析 ryhB 转录与稳定性，比较 RyhB 序列和功能特征，检测铁水平，预测和验证 RyhB 靶标，并分析血红素合成与摄取/降解系统。主要结论是：RyhB 缺失大幅抑制 Δfur 的生长和 cyt c 缺陷；Fur 抑制 ryhB 转录，Hfq 促进 ryhB 转录本稳定性；S. oneidensis RyhB 长度为 127 nt，具有独特序列和功能特征；RyhB 缺失降低不稳定铁，但该效应并非 cyt c 调控的决定因素；RyhB 不主要通过直接调控 cyt c 基因或细胞色素 c 成熟系统（cytochrome c maturation，CCM）发挥作用；RyhB 通过调节血红素水平，影响血红素生物合成关键基因和整个血红素摄取/降解系统，从而改变 cyt c 含量。

关键技术方法方面，研究人员采用遗传缺失与互补、整合型 LacZ 启动子报告、Northern blotting、5′ RACE、蛋白组与转录组比较、RNA 靶标预测工具（RNAPredator、CopraRNA、RNAtarget3、IntaRNA 2.0）、铁总量与不稳定铁测定（ferrozine、EPR、streptonigrin）、血红素 b/c 定量、SDS-PAGE 与 heme staining 及生长表型分析。蛋白组数据来自 ProteomeXchange（PXD021732），转录组数据来自已发表研究。

研究结果按原文小标题概括如下。

“RyhB 缺失大幅抑制 fur 突变体在生长和 cyt c 含量上的缺陷”：通过单缺失、双缺失、互补和过量表达，结合平板生长、细胞沉淀、heme c 定量和 heme staining，研究人员发现 ΔryhB 单缺失对生长和 cyt c 影响不显著；RyhB 过量抑制生长并降低 cyt c；ΔfurΔryhB 几乎完全抑制 Δfur 的生长和 cyt c 缺陷；从 Fur 缺失背景移除 hfq 未检测到明显影响；ΔhfqΔryhB 合成致死，仅在 IPTG 诱导 hfq 或 ryhB 回补时存活，表明 RyhB 功能不完全依赖 Hfq。

“Fur 抑制 ryhB 转录，Hfq 促进 ryhB 转录本稳定性”：通过整合型 P_ryhB-LacZ 报告和 Northern blotting，研究人员发现 ryhB 启动子在野生型 LB 中活性很低，铁限制 LB 中增加超过 4 倍；Δhfq 和 ΔryhB 中相似；Δfur 在 LB 中高活性，表明 Fur 是 ryhB 转录抑制因子。Northern blotting 显示 WT 和 Δfur 中 ryhB 转录本丰度与启动子活性一致；Δhfq 中 ryhB 转录本显著减少而启动子活性相当，说明 Hfq 促进 ryhB 转录本稳定性。

“S. oneidensis 的 RyhB 在大小和可能结构上独特”：Northern blotting 显示 S. oneidensis RyhB 为 127 nt，长于 E. coli 的 90 nt，短于 V. cholerae 的 200+ nt。其包含保守核心区、可变 RyhBup 和 RyhBdown 区以及 Rho 非依赖终止子；由典型 σ⁷⁰ 启动子驱动，5′ RACE 确定起始位点位于 Fur box 后三个核苷酸。表达不同长度片段显示，ryhB?20 无抑制活性因缺少 ?35 盒；ryhB?60 含完整启动子则消除抑制。功能替换显示 EcRyhB 与 SoRyhB 行为相同，VcRyhB 不能互补；嵌合体显示上游区重要，下游替换不影响活性；结构预测仅 Rho 非依赖终止子较可靠。

“RyhB 缺失降低细胞内不稳定铁浓度”：通过 ferrozine 法测总铁、EPR 测不稳定铁、streptonigrin 敏感性和 BsdpaAB 内源螯合剂，研究人员发现 Δfur 总铁降低而不稳定铁升高；ΔryhB 从 WT 背景影响不显著；ΔfurΔryhB 中总铁升高、不稳定铁降低，链黑菌素抗性恢复至 WT。表达 BsdpaAB 降低 Δfur 不稳定铁至 WT 水平后，Fur 缺失对 cyt c 的损害不再显著；但在 WT 中 BsdpaAB 表达降低 cyt c，而 ΔryhB 或 ΔfurΔryhB 不降低，说明 RyhB 缺失导致的不稳定铁降低不是 cyt c 调控的决定因素。

“RyhB 对 cyt c 含量的影响可能不由直接调控 cyt c 基因决定”：通过比较蛋白组与转录组并进行 in silico 预测，研究人员发现 RyhB 缺失对 Fur 调节子蛋白组的影响远大于转录组；RyhB 缺失对 cyt c 和非 cyt c 的 Fur 调节子成员蛋白水平作用相反，前者升高，后者降低。CCM 系统启动子不受 RyhB 缺失或过量影响。预测靶标验证显示 petA（SO_0608）、tkt（SO_0930）和 SO_1994 受 RyhB 调控，petA 结合位点 GC 突变为 CG 后破坏调控；但靶标列表仅含三个 cyt c 基因 SO_1421、SO_2727 和 CoxB（SO_4706），因此直接调控不太可能是 cyt c 含量增加的主因。

“RyhB 缺失导致血红素生物合成增强和血红素摄取/降解降低”：研究人员转向血红素合成、摄取和降解。S. oneidensis 具有 C5 途径合成血红素，其中 HemA 和 HemH 最关键。蛋白组显示 ΔryhB 与 ΔfurΔryhB 间多数血红素合成酶无显著差异，但 HemH1/HemH2 在双突变中上调；LacZ 报告显示 hemH1 和 hemH2 是唯一在 RyhB 缺失时升高、过量时降低的 hem 基因。血红素摄取/降解三个操纵子 hmuAXZ、tonB1-exbB1-exbD1 和 hmuBCV 在 RyhB 缺失时显著下调，最多达 5 倍，并经 LacZ 验证。血红素定量显示，ΔccmF 和 ΔryhB 可检测到细胞内 heme，WT 不可；ryhB 表达使 ΔccmF 和 ΔryhB 的 heme 水平随 IPTG 浓度增加而降低，ΔccmFΔryhB 中更明显。利用 Δfeo 生长实验显示，ΔfeoΔryhB 生长不能被 hemin 改善，说明 RyhB 缺失负影响血红素摄取。以上表明 RyhB 调控血红素稳态。

讨论部分总结认为，S. oneidensis 在能量转换和环境生物修复中潜力巨大，其呼吸多样性依赖 cyt c，而高细胞内铁含量使细胞对活性氧和辐射敏感，因此铁稳态调控一直是研究重点。E. coli 中 Fur-RyhB 为拮抗关系；本研究中 RyhB 缺失抑制 Δfur 的 cyt c 降低，支持整体 cyt c 蛋白升高，但不支持直接调控为主要原因，因为 RyhB 调节子最多含三个 cyt c 基因。虽然 RyhB 缺失抵消极铁稳态破坏，但其对 Fur 的拮抗不延伸到 cyt c 生物合成调控。cyt c 含量是 CCM 系统、cyt c 基因表达和血红素供给的综合结果；CCM 不受 Fur 或 RyhB 调控；cAMP-Crp 直接激活大量 cyt c 基因，过量单个或少数 cyt c 基因一般不影响 cyt c 含量，因此 RyhB 直接调控可能性低。血红素水平升高可增加 cyt c。Fur 直接抑制血红素摄取/降解，Hfq 影响血红素合成和降解；RyhB 调控 hemH1 和 hemH2，提示其可能主要依赖 Hfq 调控血红素合成。S. oneidensis 铁稳态还涉及 SsoR 等属特异调节因子，Fur、Hfq 和 RyhB 可能演化出不同于 E. coli 的调控机制。原文提到 Fur 和 Hfq 合成致死，但本研究获得 fur hfq 双敲除；相反，Hfq 与 RyhB 构成合成致死对，关键过程仍在研究中。

研究结论翻译：总体而言，这项工作强调了 RyhB 介导的转录后调控在 S. oneidensis 生理学中的重要性，揭示了 RyhB 影响 cyt c 生物合成的意外机制。所呈现的数据表明，由 RyhB 调控的某一细菌中的生物过程高度复杂，相当于需要多种调控因子的协调，使细胞能及时响应环境变化。