《Journal of Clinical Microbiology》：Rapid and specific identification of emerging Trichophyton mentagrophytes genotype VII using an in-house developed and validated real-time PCR assay
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须癣毛癣菌基因型VII（Trichophyton mentagrophytes genotype VII, TmVII）是一种新发的皮肤癣菌，主要与性传播相关，可引起持续性、疼痛性及炎症性皮肤损害。TmVII属于趾间毛癣菌/须癣毛癣菌复合群（T. inte
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须癣毛癣菌基因型VII（Trichophyton mentagrophytes genotype VII, TmVII）是一种新发的皮肤癣菌，主要与性传播相关，可引起持续性、疼痛性及炎症性皮肤损害。TmVII属于趾间毛癣菌/须癣毛癣菌复合群（T. interdigitale/T. mentagrophytes species complex, TiTmSC），该复合群包含28种基因型。为实现对TmVII的快速特异性鉴定，研究人员开发了一种实时荧光定量PCR（real-time PCR, rt-PCR）方法，靶向内部转录间隔区1（internal transcribed spacer 1, ITS1）中三个独特的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）。通过在两引物3′末端引入错配碱基增强了检测特异性。使用培养TmVII分离株的基因组DNA（genomic DNA, gDNA）验证，该检测方法表现出高灵敏度，最低可检测0.0002 ng gDNA/rt-PCR。该方法特异性强，当循环阈值（cycle threshold, Ct）截断值设为37时，与其他真菌病原体无交叉反应。在检测的497株霉菌分离株中，47株经rt-PCR确认为TmVII，与标准ITS-PCR/Sanger测序结果完全一致。该rt-PCR方法具有高灵敏度、高特异性、良好的可重复性和快速性，DNA提取后1天内即可获得结果，而Sanger测序需要2至7天。未来计划与医疗机构合作，使用原发皮肤样本开展研究，有望进一步提升该TmVII rt-PCR检测方法的诊断应用价值。
论文解读文章
一、研究背景与目的
须癣毛癣菌基因型VII（Trichophyton mentagrophytes genotype VII, TmVII）是一种新出现的皮肤癣菌病原体，主要与性接触传播相关，引起体癣和耻骨生殖器区域癣菌感染。2019年德国研究团队首次在37例性传播感染病例中鉴定出这一新基因型，其特征为环形炎症性、鳞屑性、疼痛、瘙痒且持续不退的皮肤损害。此后，该病原体已传播至法国、意大利、英国、西班牙、中国和美国等多个国家和地区。TmVII属于趾间毛癣菌/须癣毛癣菌复合群（TiTmSC），该复合群包含28种基因型，包括6种趾间毛癣菌（T. interdigitale）和22种须癣毛癣菌（T. mentagrophytes）基因型。基因型水平的鉴定至关重要，因为不同TiTmSC成员在传播机制、感染部位偏好和耐药谱方面存在显著差异。
目前存在的主要问题包括：基于传统培养形态学无法区分至基因型水平，因为缺乏独特的宏观或微观特征；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）因蛋白峰重叠也无法区分复合群内基因型；现有的环介导等温扩增、实时定量PCR（rt-qPCR）及商品化多重rt-PCR检测试剂盒DermaGenius 2.0虽可鉴定至种水平，但无法区分基因型。目前唯一准确的TmVII鉴定方法是对内部转录间隔区（ITS）进行常规PCR扩增后行Sanger测序，再与TiTmSC全部28种基因型的ITS序列进行多重比对，但该过程耗时且成本高昂。此外，TmVII感染常被误诊为非感染性皮肤病（如银屑病）或其他性传播感染，延误治疗可能导致继发细菌感染和持续传播。因此，迫切需要一种简便快速的方法来鉴定TmVII，以实现及时治疗并阻止病原体进一步传播。
二、研究内容与结论
为解决上述问题，研究人员开发了一种基于TaqMan探针的高灵敏度TmVII特异性rt-PCR检测方法。该方法靶向TiTmSC 28种基因型多重比对中发现的TmVII在ITS1区域内三个独特的SNPs。引物设计使其中两个TmVII特有SNPs位于正向引物（C>G）和反向引物（C>T）的3′末端，探针则结合第三个独特SNP（C>T）。为进一步增强引物特异性，研究人员在正反向引物3′区域引入了错配碱基，该方法称为“聚合酶延伸阻断”（Polymerase Extension Block），通过抑制聚合酶在引物3′末端最后1至5个核苷酸发生错配时的延伸活性，作为聚合酶延伸的屏障，从而提高检测特异性。虽然这种严格设计可能降低了整体PCR效率，但实现了对TmVII的100%特异性且未损害检测灵敏度。
三、主要关键技术方法
研究人员从2023年至2025年间纽约市及周边县多家医疗机构收集TmVII临床分离株。密切相关的TiTmSC成员（包括T. interdigitale I、II、XI型，T. mentagrophytes II、III、IV、XVIII型，以及新种T. indotineae，即原T. mentagrophytes VIII型）及其他皮肤癣菌和非皮肤癣菌霉菌通过内部ITS-PCR/Sanger测序方案鉴定。酵母菌通过MALDI-TOF MS鉴定。DNA提取后于?80°C保存备用。rt-PCR反应体系包含1× PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix、0.4 μM正反向引物、0.1 μM探针及2 μL浓度范围为0.0001至10 ng/μL的分离株DNA，反应总体积20 μL，在QuantStudio 7 Pro Dx仪器上运行，循环条件为95°C 60秒；45个循环的95°C 15秒和62°C 50秒。灵敏度评估采用三个TmVII分离株gDNA从10 ng/μL至0.00001 ng/μL系列稀释，同日及3个不同日各三重复检测。检测限（LOD）采用probit分析及四参数逻辑回归（4PL）确定，定义为所有重复中≥95%阳性检出率的最低浓度。特异性评估使用72种真菌病原体的gDNA，包括TiTmSC成员、其他毛癣菌属、小孢子菌属、絮状表皮癣菌及其他霉菌和酵母菌。验证实验采用盲法面板，包含31个TmVII分离株（不同gDNA浓度，其中一个浓度接近LOD）和17种其他霉菌。
四、研究结果
TmVII rt-PCR具有高灵敏度、高特异性和良好的可重复性
通过3个独立患者分离株在3个不同日期的三重复检测计算检出率，每个gDNA浓度共27个重复，Ct阈值为37。采用4PL回归分析计算LOD95为0.000035 ng/PCR，实际选择0.0002 ng gDNA/rt-PCR作为LOD，该浓度下100%样本可检出TmVII。相关系数（R2=0.9988）表明在六个数量级范围内具有优异的线性关系。扩增效率（e=76%）略低于普遍接受的90%，但不影响检测灵敏度。检测方法具有良好的可重复性，3个不同TmVII分离株在同日及3个不同日期的gDNA浓度检测中获得一致的Ct值。检测特异性高，Ct截断值设为37时与相近或远缘真菌病原体均无交叉反应。盲法面板中，该检测在0.002至20 ng/rt-PCR的gDNA浓度范围内均可检出TmVII。少数非TmVII皮肤癣菌在极高gDNA浓度（20 ng/rt-PCR）下产生低扩增产量，Ct值高于37；其余霉菌和酵母菌均无扩增产物，证实了该检测方法的高准确性。
TmVII rt-PCR展现出高性能
回顾性研究检测了231株真菌病原体的gDNA，其中38株TmVII阳性，Ct值范围为17至22。少数TiTmSC内其他皮肤癣菌（包括T. indotineae n=8、T. interdigitale I n=2、T. interdigitale II n=1、T. mentagrophytes II* n=4）产生39至45的Ct值，超过37的截断值。前瞻性研究检测了2025年7月1日至9月16日期间接收的266株霉菌分离株，其中9株在DNA提取后1天内被rt-PCR鉴定为TmVII，Ct值范围为16至29。8株产生40至45的Ct值，经Sanger测序确认其中5株为T. indotineae、2株为T. interdigitale II、各1株为T. mentagrophytes II和Cystobasidium slooffiae。综合回顾性和前瞻性研究，该检测方法性能优异，灵敏度100%（95% CI: 92.5%–100%），特异性100%（95% CI: 99.2%–100%）。Tm*VII鉴定在gDNA提取后1天内即可完成，而ITS-PCR/Sanger测序需要2至7天。
五、讨论与结论
TmVII是一种新出现的皮肤癣菌，主要与男男性行为者中的性传播相关，但也有涉及母亲、父亲和子女的家庭内传播病例报道。自鉴定以来已在全球范围内传播，引起医疗专业人员的高度关注。美国首例TmVII感染病例于2024年7月报道，随后出现多例病例。近期纽约的TmVII病例快速增长，提示该皮肤癣菌可能存在克隆性扩张。现有文献表明TmVII感染对一线药物特比萘芬反应良好，而T. indotineae则不然。虽然需要延长治疗时间（>8周），TmVII通常对特比萘芬敏感，尤其是纽约流行的菌株。然而，2026年报道了首例特比萘芬耐药TmVII病例，患者为一名突尼斯异性恋女性，在土耳其旅行期间性接触后感染，表现为快速进展、剧烈瘙痒的生殖器损害，对特比萘芬治疗无反应，抗真菌药敏试验证实该分离株对特比萘芬耐药（MIC>8 μg/mL），后经二线抗真菌药伊曲康唑成功治愈。这一发现令人担忧，因为特比萘芬耐药的T. indotineae已在全球广泛传播，包括美国。
虽然已有一些快速检测方法可用于T. indotineae鉴定，但尚无针对TmVII的快速诊断检测。由于缺乏所有基因型的全基因组测序数据，ITS区域仍是引物和探针设计的唯一可行选择。TmVII的ITS区域恰好存在三个独特SNPs，使得设计该基因型特异性引物和探针成为可能。在497株经rt-PCR检测的霉菌中，47株确认为TmVII，与ITS Sanger测序结果一致。少数Ct值高于37的分离株经Sanger测序确认为其他TiTmSC基因型，进一步证实了检测特异性。
及时识别和适当治疗TmVII感染对于控制其传播和优化患者预后至关重要。该TmVII rt-PCR检测方法在DNA提取后1天内即可获得结果，而常规ITS PCR和Sanger测序需要2至7天。这种高灵敏度、高特异性和快速的检测方法有望提升诊断能力、改善患者预后并加强感染控制措施。当前研究仅使用分离株进行鉴定，存在一定局限性。因此，未来计划与医疗机构合作使用原发皮肤样本开展研究，以增强该TmVII rt-PCR检测方法的诊断应用价值。在此之前，研究人员建议临床实验室在初步尿素酶和毛发穿孔试验阳性后，将从皮疹中分离的T. mentagrophytes菌株提交至具备T. mentagrophytes基因分型能力的参考实验室。
