一种包封重组衣壳蛋白的生物矿化碳酸钙纳米疫苗可诱导石斑鱼对神经坏死病毒产生强烈的保护性免疫

《Fish & Shellfish Immunology》：A biomineralized calcium carbonate nanovaccine encapsulating recombinant coat protein elicits robust protective immunity against nervous necrosis virus in grouper

　　

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  开发一种靶向神经坏死病毒 (NNV) 的生物矿化纳米疫苗 (CaCO3@CP)。
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  CaCO3@CP 在石斑鱼中引发强烈且持久的全身细胞性和体液免疫。
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  在致死性 NNV 攻击下，疫苗接种实现了 68.89% 的存活率和显著的病毒清除。

引言

病毒性疾病，特别是由神经坏死病毒 (NNV) 引起的病毒性神经坏死 (VNN)，对全球海洋水产养殖构成了毁灭性威胁 [1]。NNV 是一种属于结节病毒科 (Nodaviridae) 的单股正链 RNA 病毒，能够感染数百种海洋和淡水硬骨鱼类，包括尖吻鲈 (Lates calcarifer) 和石斑鱼 (Epinephelus spp.) 等高价值商业物种 [2]。该病毒通过水平途径（如水体暴露和共同饲养）和垂直途径（亲代通过配子传给后代）迅速传播，使得在集约化养殖环境中控制疫情变得异常困难。在病理上，NNV 选择性地攻击宿主的中枢神经系统，诱导神经和视网膜空泡变性坏死，导致幼鱼死亡率频繁高达 100% [3,4]。随着水产养殖的快速集约化和工业化，NNV 的爆发继续给全球水产养殖业带来严重的经济损失。在商业养殖中，由于缺乏有效的 VNN 治疗药物，必须高度重视预防措施 [3]。因此，通过战略性疫苗接种建立强大的免疫屏障是疾病控制最可靠的方法。

在多种 NNV 疫苗开发策略中，重组亚单位疫苗因其固有的安全性而获得了显著关注 [5]。NNV 具有简化的结构架构，仅由单一的衣壳蛋白 (CP) 组成 [6,7]。CP 的异源表达使其能够自组装成类病毒颗粒 (VLPs)，这些颗粒通过模拟天然病毒结构而不携带感染性遗传物质，成为具有高免疫原性和安全性的疫苗候选者 [[8], [9], [10]]。Liu 等人肌肉注射表达了 Cp P 结构域中和表位的线性重复蛋白的龙胆石斑鱼 (Epinephelus lanceolatus)，显著提高了抗体水平，并实现了 72% 的相对保护率 (RPS) [11]。同样，Kim 等人利用无细胞蛋白合成系统表达 NNV 衣壳蛋白，并免疫云斑石斑鱼 (Epinephelus septemfasciatus)，赋予其针对致死性 NNV 攻击的有效保护 [12]。然而，常规亚单位疫苗在水产养殖中的转化应用严重受制于其结构脆弱性。未保护的重组蛋白极易受到血清和黏膜组织中存在的内源性蛋白酶快速酶解的破坏，同时也易受温度波动和 pH 值变化等环境胁迫的影响。这种降解导致快速全身清除、生物利用度降低以及向抗原呈递细胞 (APCs) 呈递不佳。因此，实现有效保护需要多次大剂量佐剂免疫，这显著增加了生产成本和劳动强度，从而阻碍了工业应用。

近几十年来，基于纳米粒子的递送平台因其独特的物理特性在疫苗工程中获得了极大关注 [[13], [14], [15], [16]]。其高比表面积、可调的粒径和可定制的化学表面提供了明显的临床优势 [17,18]。这些平台能有效提高药物生物利用度，实现配体靶向递送，并促进控制释放动力学。在各种无机生物材料中，碳酸钙 (CaCO₃) 脱颖而出，成为一种有吸引力的载体。它资源丰富、成本低廉、生物相容性高，并具有理想的骨传导性和理化特征，允许在温和的水溶液条件下直接矿化，而无需将脆弱的蛋白抗原暴露于变性有机溶剂或高剪切应力中 [[19], [20], [21]]。关键的是，CaCO₃ 表现出独特的 pH 响应性降解特征 [22]。据报道，基于 CaCO₃ 的载体在近中性条件下表现出相对稳定性，而在酸性微环境（包括内体 - 溶酶体区室）中发生加速溶解 [23]。这种酸性溶解促进了内体逃逸并触发货物释放，从而显著提高了 APCs 摄取和交叉呈递效率。尽管 CaCO₃ 矿化技术在哺乳动物药物递送和癌症免疫治疗中已得到广泛利用，但在水生病毒疫苗中的应用仍相对较少探索 [24,25]。

为了开发更高效的纳米疫苗，我们通过共沉淀法构建了一种矿化亚单位疫苗 CaCO₃@CP。我们全面评估了该体系的理化属性，重点关注其粒径、表面电位和结构形态。此外，以经济价值重要的龙虎斑幼体 (Epinephelus coioides) 为靶模型，我们系统评估了 CaCO₃@CP 触发固有免疫信号通路、全身体液抗体反应和细胞介导免疫反应的能力，并评估了其针对致死性 NNV 攻击的保护效力。我们的研究结果为海洋水产养殖中的病毒性疾病控制提供了一种新颖、经济高效且高效的抗原递送平台。

章节摘要

实验材料

分析级无水氯化钙 (CaCl₂)、无水碳酸钠 (Na₂CO₃)、聚丙烯酸钠 (PAANa) 和 HEPES 缓冲液由深圳市希龙科学有限公司提供。小鼠抗石斑鱼免疫抗体（靶向 CD4、MHC-I、CD8、MHC-II、TNF-α和 IL-1β）由我们实验室制备和保存。HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 购自碧云天生物技术（中国），而小鼠抗石斑鱼 IgM 抗体（货号 F05）由

CaCO₃@CP 纳米疫苗的合成与表征

重组 CP 蛋白通过 E. coli 原核系统表达。SDS-PAGE 和 Western blot 分析均在 43 kDa 处显示出一条显著条带，与预测的分子量相符。（图 1B 和 C）。SEM 成像显示 CaCO₃@CP 纳米颗粒呈现均匀的球形形态（图 1D）。使用结合能量色散 X 射线光谱的扫描电子显微镜 (SEM–EDS) 检查了 CaCO₃@CP 纳米颗粒的元素组成和空间分布（图 S1）。元素

讨论

神经坏死病毒 (NNV) 是病毒性神经坏死 (VNN) 的致病因原，仍是全球海洋鱼类养殖高死亡率的主要驱动因素。战略性疫苗接种对有效控制 VNN 至关重要 [27,28]。基于衣壳蛋白 (CP) 的重组亚单位疫苗提供了一种安全的预防策略，降低了与减毒或灭活全病毒疫苗相关的生物安全风险 [29]。然而，游离重组蛋白通常具有物理

结论

总之，本研究表明基于 CaCO₃ 的生物矿化提供了一种创新、经济高效且高效的水生亚单位疫苗递送平台。通过提高抗原稳定性和向免疫组织的递送，CaCO₃@CP 有效刺激了固有和适应性免疫通路，促进了协调的 MHC-I/MHC-II 激活，并诱导了对 NNV 感染的强效保护性免疫。该矿化平台显示出强大的应用潜力

作者声明

我们想提请编辑注意以下可能被视为潜在利益冲突的事实，以及对本研究的重要财务贡献。

我们确认所有署名作者均已阅读并批准该手稿，且没有其他符合作者资格标准但未列出的人员。我们进一步确认，手稿中列出的作者顺序已得到我们所有人的批准。

我们确认我们已给予适当

资金

本研究获得的财政支持来自海南省重点研发计划 (ZDYF2026XDNY131)，海南省种业实验室 (项目B24H10034)，海南省南海新星科技创新人才项目 (NHXXKJCX202501)。海南省高等教育科研机构科研项目 (Hnky2025-9)，国家重点研发计划 (2023YFD2402700)。

利益冲突声明

作者已声明不存在利益冲突。

Xinxin Liu|Hongli Liu|Ting Wu|Bo Li|Guohui Liu|Yongcan Zhou|Yun Sun|Chen Zhang|Longfei Lu