《Food Bioscience》：Engineering a Membrane-Bound Dehydrogenase-Deficient Chassis of
Gluconacetobacter tumulisoli FBFS 97 for Enhanced Production of the Rare Sugar 5-Keto-D-Fructose
编辑推荐：
•依次删除九个膜结合脱氢酶，构建了GT-9菌株。•重新引入天然fdhSCL操纵子重建了D-果糖的氧化。•GT-9-Pkan-fdh增强了D-果糖向5-酮果糖的转化。•该工程底盘为AAB中稀有糖的生物转化提供了平台。引言醋杆菌属（AAB）是一类严格好氧的革兰氏阴性微生物，属于α
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依次删除九个膜结合脱氢酶，构建了GT-9菌株。
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重新引入天然fdhSCL操纵子重建了D-果糖的氧化。
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GT-9-Pkan-fdh增强了D-果糖向5-酮果糖的转化。
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该工程底盘为AAB中稀有糖的生物转化提供了平台。
引言
醋杆菌属（AAB）是一类严格好氧的革兰氏阴性微生物，属于α-变形菌纲，广泛分布于富含糖、酸和醇的环境，如发酵食品、水果和花卉中（Gomes等，2018）。AAB被广泛用作全细胞生物催化剂进行氧化生物转化，这得益于其不完全氧化多种底物的能力，包括糖类、醇类和多元醇（Raspor & Goranovi?，2008）。这种独特的代谢能力使其在生产葡萄糖酸、维生素C前体和5-酮-D-果糖（5-KF）等高附加值化合物方面得到广泛应用（Lynch等，2019；Saichana等，2015；Sengun & Karabiyikli，2011）。在工业过程中，AAB特别具有吸引力，因为这些氧化反应在温和条件下进行，并直接与呼吸链偶联，无需大量辅因子再生或复杂的下游加工即可实现高效的底物转化（Gao等，2020；Gomes等，2018）。
AAB的氧化代谢主要由膜结合脱氢酶（mDHs）介导，这些酶位于细胞质膜上，其催化结构域延伸至周质空间（Adachi & Yakushi，2016；Deppenmeier等，2002）。这些mDHs可直接氧化底物并将电子传递至呼吸链。与细胞质中依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[NAD(P)H]等高昂辅因子的可溶性氧化还原酶不同，mDHs的催化过程不需要外源辅因子，且具有优异的催化效率，能够实现底物的稳定和连续氧化。尽管具有这些优势，野生型AAB菌株在生物催化中的应用面临一个重大挑战：多种底物谱重叠且广泛的mDHs同时表达（Matsushita等，2016）。因此，单一底物可通过多条竞争性途径被同时氧化，导致非目标副产物积累和目标化合物形成减少。这种非特异性氧化反应不仅降低了产品选择性和收率，还使下游加工复杂化。因此，迫切需要开发策略来最小化非特异性氧化背景并增强产品特异性。
为解决这一问题，先前的研究探索了针对单个脱氢酶的代谢工程策略（Matsushita等，2016）。采用靶向基因删除或酶失活策略来研究单个mDH的生理功能，在某些情况下还可减少竞争性氧化反应并提高目标产物的形成（Matsushita等，2016；Prust等，2005）。然而，由于mDHs之间的冗余性和功能重叠，操纵单个mDH的生理后果往往难以在网络水平上解释。为解决这一复杂性，Peters等（2013）证明了构建具有多个mDH基因被删除的AAB菌株的可行性。然而，在不同AAB遗传背景下，大量mDH删除是否产生相似的生理和生物催化后果仍不清楚，因为AAB物种间mDH库的差异可能导致对mDH消除的不同响应。因此，系统构建和表征具有简化膜结合氧化网络的AAB菌株，可能为了解mDHs的生理功能提供有价值的见解，并促进AAB基生物催化剂的理性开发，用于靶向氧化生物转化。
稀有糖因其多样的理化性质以及在食品、制药和化工领域的潜在应用而受到越来越多的关注（Dai & Jin，2024；Van Laar等，2021）。其中，5-KF是一种稀有的酮糖，在蜂蜜、白葡萄酒和醋等产品中以微量水平天然存在（Barbe等，2001；Blasi等，2008；de Azevedo等，2007）。5-KF作为生物技术应用的高附加值化合物日益受到关注。然而，近期一项研究报告了5-KF的浓度依赖性细胞毒性效应，并对其作为糖替代品的直接适用性提出了担忧（H?vels等，2022）。尽管如此，开发高效的微生物平台生产5-KF，对于进一步研究其性质和潜在应用仍然具有重要意义。
目前，5-KF的微生物生产主要通过Gluconobacter oxydans利用果糖脱氢酶（FDH）介导的D-果糖氧化实现（Battling等，2022；Siemen等，2018）。通过发酵优化和过程工程提高5-KF产量已取得相当进展。然而，这些研究主要集中于过程优化，而内源mDHs对产品选择性的影响则受到较少关注。由于多种mDHs在AAB中往往共存并表现出重叠的底物特异性，非目标氧化反应可能降低5-KF生产的效率和选择性。Gluconacetobacter tumulisoli FBFS 97（FBFS 97）是一种新近分离的AAB，其膜结合氧化系统在很大程度上仍未被探索。我们之前的研究证明了该菌株中进行基因操纵的可行性（Liu等，2025）。然而，FBFS 97膜结合氧化网络的系统工程和表征尚未见报道。因此，简化FBFS 97的膜结合氧化背景可能为研究mDHs的生理功能并评估其对FDH介导的D-果糖氧化的影响提供有用的策略。
在本研究中，我们分析了FBFS 97的mDH库，并使用无痕基因删除策略依次删除编码九个预测mDH系统必需亚基的基因，构建了GT-9菌株，从而破坏了相应的酶复合体。为评估FDH介导的D-果糖氧化在GT-9背景下的可行性，将FBFS 97的膜结合果糖脱氢酶操纵子（fdhSCL；以下简称fdh）在组成型启动子Pkan的调控下引入GT-9，构建工程菌株GT-9-Pkan-fdh。这种方法使我们能够检查减少内源mDH背景是否会影响D-果糖氧化和5-KF的形成。随后评估了工程菌株的生理特性及其在D-果糖生物转化中的表现。本研究为了解mDHs在AAB中的生理功能提供了见解，并探索了简化膜结合氧化背景用于5-KF生产的应用。
章节摘要
菌株、质粒和培养基
保存在我们实验室的FBFS 97菌株（Li等，2020）被用作母体以产生突变体。质粒pKOS6b既作为敲除载体，也作为扩增Pkan启动子的模板，该启动子先前已被描述为源自FBFS 97中卡那霉素抗性基因的相对强组成型启动子（Liu等，2025）。质粒pBBR1MCS-5由中国农业微生物国家重点实验室的Wenli Chen实验室提供
FBFS 97中假定的mDHs鉴定
基因组注释结合同源搜索和结构分析在FBFS 97中鉴定了九个假定的mDH基因（图1）。这些蛋白含有与醌依赖性氧化系统相关的特征催化结构域，部分蛋白具有一个或多个预测的跨膜螺旋，表明其可能参与膜结合氧化代谢。鉴定的酶代表了多种mDH类别，包括PQQ依赖性、MCD依赖性、FAD依赖性
讨论
AAB具有由多种mDHs组成的复杂膜结合氧化系统，这些酶参与底物氧化和呼吸电子传递。先前的研究已证明在AAB中破坏多个mDH系统的可行性（Peters等，2013）；然而，mDHs的组成和分布在不同物种间存在显著差异（Gomes等，2018；Prust等，2005）。因此，对mDH网络进行广泛改造的生理后果可能
结论
在本研究中，系统分析了FBFS 97的预测mDH系统，并通过无痕破坏编码这些系统必需亚基的基因构建了GT-9。表型表征显示，GT-9仍然存活并保留了利用大多数测试碳源的能力，同时表现出菌落直径减小、菌落相关表面结构改变以及独特的细胞表面超微结构特征。这些发现表明
作者贡献声明
刘一军：可视化、方法论、数据整理。宋佳昀：调查研究、形式化分析。杨浩然：写作—审阅与编辑、概念化。Wolfgang Liebl：写作—审阅与编辑。陈复生：写作—审阅与编辑、监督、资源、项目管理、方法论、资金获取、概念化。马艳琴：写作—原稿撰写、可视化、方法论、调查研究、形式化分析、概念化
未引用参考文献
Ryngaj??o等，2020；Schiessl等，2021。
数据可用性声明
本研究呈现的数据包含在文章中，进一步咨询可联系通讯作者。
资助
本工作得到了湖北省技术创新重大项目（编号：2018ABA075）和国际合作科学技术部项目计划（编号：2014DFG32380）的支持。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本研究中报告的工作。
马艳琴|刘一军|宋佳昀|杨浩然|Wolfgang Liebl|陈复生
