开发用于检测对大鼠 PXR 具有激动剂活性的化学物质的双分子生物传感器

《Food and Chemical Toxicology》：Development of bimolecular biosensors to detect chemicals with agonist activity toward rat PXR

　　

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  开发了基于 NanoBiT 的生物传感器以检测大鼠 PXR 的激活。
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  这些生物传感器检测 PXR 及其共激活因子之间配体依赖性的相互作用。
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  两种优化策略提高了生物传感器的配体响应性。
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  生物传感器与传统检测方法显示出大致相似的响应特征。
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  该检测方法为评估化学物质诱导的 PXR 激活提供了一个快速平台。

Introduction

孕烷 X 受体 (PXR)—核受体 (NR) 超家族的一员—在肝脏和肠道中高度表达，在那里它在调节关键生理功能方面起着重要作用 (Ihunnah et al., 2011; Kliewer et al., 2002; Mackowiak et al., 2018)。例如，PXR 调节编码异生物质代谢酶的基因表达，如细胞色素 P450 3As (Xie et al., 2000) 和 UDP-葡萄糖醛酸转移酶 (Xie et al., 2003)，以及参与能量代谢的基因，包括肉碱棕榈酰转移酶 1A 和 3-羟基 -3-甲基戊二酰-CoA 合成酶 2 (Nakamura et al., 2007)。值得注意的是，PXR 在其配体结合域 (LBD) 内具有一个特别大且灵活的口袋，能够容纳各种结构多样的内源性和外源性配体 (Lehmann et al., 1998; Lynch et al., 2021; Xia et al., 2011)。这些独特特性使 PXR 能够作为异生物质传感器发挥作用。因此，PXR 被认为是有吸引力的分子靶标，用于化学物质安全评估，因为化学物质诱导的 PXR 活性调节可以改变基因表达并可能导致不良生物结局。

激动剂结合诱导 PXR LBD 发生构象变化，从而促进与视黄酸 X 受体 (RXR) 的异源二聚化，与转录共因子的结合或解离，以及结合到靶基因中的 DNA 应答元件 (Ihunnah et al., 2011)。在此过程中，激活功能 2 (AF2)—位于 LBD C 末端的 α-螺旋—在配体依赖性的转录调节中起着关键作用 (Burris et al., 2013; Nagy and Schwabe, 2004)。激动剂结合后，AF2 稳定在活性构象，这有助于形成共激活因子结合表面，促进通过其保守的 LXXLL 基序招募共激活因子 (Watkins et al., 2003)。与 PXR LBD 相互作用的代表性共激活因子包括类固醇受体共激活因子 (SRC) 家族成员和过氧化物酶体增殖物激活受体 gamma 共激活因子 1 alpha (PGC1α) (Rigalli et al., 2021)。

近年来，经济合作与发展组织 (OECD) 推动了不良结局路径 (AOPs) 的开发，这些路径描述了分子启动事件 (MIE)、发生在不同生物组织水平的一系列后续关键事件 (KEs) 和不良结局 (AO) 之间的因果联系 (Villeneuve et al., 2014)。AOPs 提供了一种机制框架，用于基于当前科学知识理解化学暴露如何导致不良生物效应 (Ankley et al., 2010)。因此，鼓励开发基于 AOPs 的体外和计算机模拟评估方法。这些方法预计通过基于机制的评估提高化学物质安全评估的效率，同时减少对动物实验的依赖，从而支持动物福利。在潜在的 MIE 中，NR 的激活被认为对 AOP 开发特别有用。例如，提出了一种 AOP，其中化学物质诱导的 PXR 激活作为 MIE，导致肝脂肪变性作为 AO (Itkonen et al., 2023)。因此，检测化学物质诱导的 PXR 激活的敏感且高效的方法对于基于机制的化学物质安全评估非常重要。

目前，使用培养细胞的荧光素酶 (Luc) 报告基因检测法是体外评估化学物质与 NR 之间相互作用的最广泛应用的方法之一。常用两种主要类型的 Luc 报告基因检测法：(i) 由全长 NR 及其靶启动子组成的系统，以及 (ii) 由酵母转录因子 GAL4 和 NR LBD 的融合蛋白以及 GAL4 响应启动子组成的哺乳动物单杂交系统 (Schulman and Heyman, 2004)。在之前的研究中，我们使用后一种系统全面评估了工业化学物质与五种大鼠 NR（包括 PXR）之间的相互作用，并报告了它们的 NR 激活特征 (Kodama et al., 2021)。然而，常规报告基因检测系统在大量化学物质的全面评估中存在一些局限性。例如，这些检测通常从开始到数据获取需要大约三天时间——包括细胞接种、转染、化学处理和信号检测。导致这一相对较长检测时间的主要贡献因素是，需要长时间暴露于化学物质以使报告蛋白充分表达和积累以供检测。结果，测试化学物质的细胞毒性效应可能会影响细胞反应，从而潜在地损害检测结果的准确性。

最近，报道了一种基于维生素 D 受体 (VDR)（NR 超家族的一员）LBD 与共激活因子之间相互作用来检测内源性激动剂的方法，该方法使用 NanoLuc 二元技术 (NanoBiT) (Mano et al., 2023)。NanoBiT 是一种蛋白质 - 蛋白质相互作用检测法，由来自Oplophorus gracilirostris NanoLuc 荧光素酶的分裂片段 LgBiT (17.6 kDa) 和 SmBiT (11 个氨基酸残基) 组成 (Hall et al., 2012; Dixon et al., 2016)。VDR 激动剂检测系统包括两种融合蛋白，VDR LBD-SmBiT 和 LgBiT-LXXLL，它们响应激动剂结合而结合和解离 (Mano et al., 2023)。与上述常规方法不同，该系统检测 Luc 活性的重组，而不是 Luc 报告基因的表达，从而能够实时检测化学物质 -LBD 相互作用。基于这一概念，我们将大鼠 PXR (rPXR) LBD 整合到这一策略中，并开发了对表现出针对 rPXR 激动剂活性的化学物质做出反应的二分子生物传感器。基于这些生物传感器的检测系统表现出高检测灵敏度，并通过提供大幅缩短的检测时间，可能为常规 Luc 报告基因检测提供有用的替代方案。这些特征使该系统成为化学物质安全评估中快速评估化学物质诱导的 PXR 激活的有力工具。

Section snippets

Materials

二甲基亚砜 (DMSO) 和地西泮 (CAS RN 439-14-5) 购自富士胶片和光纯药 (日本大阪)。孕烯醇酮 16α-氰化物 (PCN, CAS RN 1434-54-4)、磷酸三 (2-丁氧乙基) 酯 (TBP, CAS RN 78-51-3)、达那唑 (CAS RN 17230-88-5)、地塞米松 (CAS RN 50-02-2)、米非司酮 (CAS RN 84371-65-3) 和利福平 (CAS RN 13292-46-1) 购自 Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)。蒽酮 (CAS RN 82-05-3) 购自东京化学工业 (东京，

设计针对 rPXR 的激动剂活性的二分子生物传感器

我们专注于 rPXR LBD 与共激活因子之间配体依赖性的相互作用，并将此机制与 NanoBiT 发光蛋白质 - 蛋白质相互作用检测系统 (由 LgBiT 和 SmBiT 组成) 相结合，以构建二分子生物传感器。此前，Mano 等人报道了 VDR LBD-SmBiT (其中 VDR LBD 融合到 SmBiT 的 N 末端) 和 LgBiT-LXXLL (其中共激活因子衍生的 LXXLL 基序融合到 LgBiT 的 C 末端) 产生了快速且强烈的

Conclusion

本研究开发的二分子生物传感器对 rPXR 激动剂表现出发光反应，将为旨在全面评估化学物质安全评估中 NR - 化学物质相互作用的检测系统提供有用的补充。与常规报告基因检测相比，它们可能有助于克服基于转录的方法的一些局限性，包括检测时间长以及测试化学物质细胞毒性效应的潜在干扰。对于未来

CRediT 作者贡献声明

Mizuki Nakai: 撰写 – 原稿，可视化，方法论，调查研究，形式分析。 Hiroki Mano: 撰写 – 审阅与编辑，方法论。 Ayumi Miyake: 撰写 – 原稿，可视化，方法论，调查研究，形式分析。 Susumu Kodama: 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，可视化，监督，方法论，资金获取，形式分析，概念化。 Toshiyuki Sakaki: 撰写 – 审阅与编辑。 Atsushi Ono: 撰写 – 审阅与

Uncited reference

Toriyabe et al., 2009; Xiao et al., 2011.

Statements and Declarations

作者声明无利益冲突。

Data availability

数据将根据请求提供。

Declaration of Competing Interest

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能被视为影响本文报告的工作。

Acknowledgments

本研究部分由日本学术振兴会 (JSPS) 资助 (19K07044, 给 S.K.)。

Ayumi Miyake|Mizuki Nakai|Hiroki Mano|Toshiyuki Sakaki|Atsushi Ono|Susumu Kodama