《Food Bioscience》：Plant-Derived Growth Substrates Modulate Biosynthetic Gene Cluster Expression and Extracellular Anti-
Salmonella Activity in
Bacillus velezensis BX77
编辑推荐：
植物源生长底物调控 Bacillus velezensis BX77 中生物合成基因簇表达及胞外抗 Salmonella 活性。
• 芽苗提取物诱导 BX77 的胞外抗 Salmonella 活性。
• 植物源生长底物诱导全部13个生物合成基因簇（biosyn
植物源生长底物调控 Bacillus velezensis BX77 中生物合成基因簇表达及胞外抗 Salmonella 活性。
• 芽苗提取物诱导 BX77 的胞外抗 Salmonella 活性。
• 植物源生长底物诱导全部13个生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）的转录重塑。
• Difficidin 和 bacilysin 基因表达与 Salmonella 失活相关。
• 比较基因组学鉴定 BX77 为一个独特的 Bacillus velezensis 菌株。
• BX77 显示出作为新鲜农产品生物防治剂（biocontrol agent）的前景。
研究背景方面，新鲜农产品被食源性病原体污染，尤其是 Salmonella 和 Escherichia coli，仍是全球食品安全的重要挑战；水果、蔬菜和发芽种子相关食源性疾病暴发屡有报道。由于许多新鲜农产品被生食，常规采后去污方法往往难以在不影响产品品质和消费者接受度的情况下消除病原体，因此需要可持续且有效的生物防治策略。Bacillus 属可形成环境耐受性孢子、定殖植物相关生态位并产生多种抗菌化合物，已被用于抑制细菌和真菌植物病原体，也被认为可能用于控制与食用植物相关的人体食源性病原体。研究人员此前鉴定到植物相关 Bacillus 菌株 BX77，其可减少苜蓿芽上 enteropathogenic Escherichia coli O55 和 Salmonella enterica serovar Typhimurium 的定殖，并抑制多种细菌和真菌植物病原体。然而，BX77 拮抗活性的分子机制，尤其是在植物相关生长条件下，仍不清楚。BGC 的存在并不必然代表活性代谢物产生，因为营养组成、代谢信号和植物源信号会影响次生代谢。因此，该研究旨在阐明 BX77 对新鲜农产品相关食源性病原体拮抗的分子基础，结合抗菌活性测定、全基因组测序、比较基因组分析和转录组分析，确定 BX77 的分类地位、抗菌生物合成潜力，并研究植物源生长条件是否调控可能参与 Salmonella 抑制的生物合成途径表达。
关键技术方法概括：研究人员以苜蓿芽苗提取物（sprout extract，SE）模拟植物源条件，并以 LB、LBGM、NB 为对照制备条件培养基（conditioned medium，CM），用 Salmonella Typhimurium SL1344 进行抗 Salmonella 活性测定、富集回收和 BX77 生物量监测。对 BX77 开展 Illumina 短读长与 Oxford Nanopore 长读长杂交全基因组测序，Unicycler 组装、Prokka 注释；用 OrthoANI、TYGS、dDDH、OrthoFinder 和 OrthoVenn3 进行分类及比较基因组分析；antiSMASH v7.0 预测 BGC，CARD/RGI、VFDB、RAST/COG/GO 和 dbCAN2 分析耐药、毒力、植物互作及碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）。转录组比较 SE 与 LB 在 0、18、36、48 h 的表达，DESeq2 鉴定差异表达基因。系统发育纳入 NCBI RefSeq 中 166 个 B. velezensis 基因组（2024-09-26）；BX77 基因组 GenBank CP166773。统计采用 GraphPad Prism、ANOVA 与 Tukey-Kramer。
研究结果如下。
3.1 Plant-derived growth substrates induce extracellular anti-Salmonella activity of BX77（植物源生长底物诱导 BX77 胞外抗 Salmonella 活性）。通过不同培养基制备 CM 并测试其对 S. Typhimurium SL1344 的抑制，LB 来源 CM 仅表现最小抑制活性，NB 和 LBGM 来源 CM 抑制依次增强，SE 来源 CM 使 Salmonella 降至不可检测水平。时间上，SE 来源 CM 在培养前18 h无可检测抗菌活性，24 h出现显著抑制，36 h进一步增强，48 h使 Salmonella 降至不可检测，且富集后未回收活菌，并维持至72 h；LBGM 来源 CM 仅在48 h出现延迟且部分活性，LB 来源 CM 在任何时间点均未显著降低 Salmonella 计数。BX77 在 SE、LB 和 LBGM 中每个采样时间点达到相当细胞密度，说明抗 Salmonella 活性差异并非源于 BX77 生物量差异，而是生长环境化学组成，且该胞外抗 Salmonella 表型受时间调控并高度依赖植物源生长条件。
3.2 Complete genome sequencing identifies BX77 as Bacillus velezensis（全基因组测序鉴定 BX77 为 Bacillus velezensis）。全基因组测序显示，BX77 基因组为单一环状染色体，大小4,150,193 bp，G+C 含量46.30%，含4,176个预测基因，包括3,971个蛋白编码序列（coding sequences，CDSs）、27个 rRNA 基因、86个 tRNA 基因和34个非编码 RNA；未检测到质粒，基因组序列提交 GenBank，登录号 CP166773。与参考菌株 FZB42、QST713 和 DSYZ 比较，OrthoANI 分别为98.86%、98.72%和98.60%，dDDH 分别为93.4%、91.1%和92.2%，均超过物种阈值，确认 BX77 为 B. velezensis 的独特菌株。基于166个公开 B. velezensis 基因组的系统发育分析将菌株分为4个主要进化支，BX77 位于 Clade D，其最近系统发育亲属为 OSY-S3。比较基因组分析显示，BX77 与三株参考菌共享3,371个同源簇，BX77 含9个菌株特异簇，共27个基因，并与 FZB42、QST713 和 DSYZ 分别额外共享13、49和95个簇，表明其具有保守的 B. velezensis 基因组框架及有限菌株特异附属基因。
3.3 BX77 possesses an extensive repertoire of antimicrobial biosynthetic gene clusters（BX77 具有广泛的抗菌生物合成基因簇）。通过 antiSMASH 分析，BX77 基因组含13个 BGC，涵盖非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）、聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）、萜烯、核糖体合成和翻译后修饰肽（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides，RiPPs）及杂合 NRPS-PKS 途径。其中7个 BGC 与已实验表征簇高度相似（91–100%），包括 surfactin、macrolactin H、bacillaene、fengycin/plipastatin、difficidin、bacillibactin 和 bacilysin；其余6个 BGC 与已知簇相似性低（7–28%）或无显著相似性，提示 BX77 可能编码未表征次生代谢物。与 FZB42、QST713 和 DSYZ 比较，总体 BGC 谱高度保守， vooral 主要抗菌代谢物相关簇，但低相似性簇存在差异，提示菌株特异次生代谢潜力。
3.4 Plant-derived growth conditions induce broad and time-dependent transcriptional remodeling of biosynthetic gene cluster regions（植物源生长条件诱导 BGC 区域广泛且时间依赖性转录重塑）。通过比较 SE 与 LB 培养在18、36和48 h 的转录组，研究人员发现13个 antiSMASH 预测 BGC 区域中每个区域至少有一个基因在至少一个时间点差异表达。转录反应具强时间依赖性：18 h 有190个区域内基因上调，36 h 为74个，48 h 为98个。在 surfactin 区域，srfAA-srfAD 在18 h 协同上调，48 h 仍高于 LB，但 sfp 在36和48 h 下调。macrolactin H 区域中7个基因在18 h 上调，邻近两个碳水化合物利用基因在18 h 强诱导并在48 h 保持高表达。bacillaene 区域中11个注释基因在18 h 上调，pksS 显著下调，邻近4个假想基因呈更强诱导。fengycin/plipastatin 区域中 ppsA-ppsE 在18 h 和48 h 上调，36 h 部分上调。difficidin 区域15个连续基因在18 h 全部显著上调，36 h 未达阈值，48 h 有11个基因再次显著上调，呈双相表达。bacillibactin 区域中 mbtH 及 dhbF、dhbB、dhbE、dhbC、dhbA 在18 h 上调，besA 也上调。bacilysin 操纵子中 bacABCDEF 在18 h 全部上调，36 h 未达阈值，48 h 再次全部上调，也呈双相表达。低相似或无相似区域1、3、4、8、9和12也含显著上调基因，尤其区域1、9和12，说明 SE 还激活了生物学功能未知的基因组区域。
3.5 Genomic assessment of antimicrobial resistance-associated genes and virulence-associated homologs in BX77（BX77 抗菌耐药相关基因和毒力相关同源物的基因组评估）。通过 CARD/RGI 筛选，BX77 含7个严格命中，对应5个抗菌耐药相关 ARO 术语，包括小多重耐药外排泵基因 qacG 和 qacJ 同源物、预测 A 类 β-内酰胺酶同源物 bcI，以及低同一性 vanT 和 vanY 同源物，其中 vanT 和 vanY 匹配约34%序列同一性；仅凭基因组分析不能确定这些预测决定簇是否导致表型耐药。与 FZB42、QST713 和 DSYZ 比较，qacG、qacJ、vanT 和 vanY 同源物存在于四株菌中；bcI 在 BX77 和 FZB42 中检测到，而 QST713 和 DSYZ 未检测到；tet(45) 同源物在 QST713 和 DSYZ 中检测到，fosB1 在 FZB42、QST713 和 DSYZ 中检测到而 BX77 未检测到。VFDB 筛选发现与运动、黏附、应激存活、免疫调节、营养或代谢功能相关的同源物，包括鞭毛蛋白、EF-Tu、GroEL、Clp 应激反应蛋白、多糖生物合成蛋白和营养获取相关蛋白；未在 BX77 基因组中鉴定到已知毒素编码基因。
3.6 Genomic features associated with plant interaction and plant growth-promotion potential（与植物互作和植物促生潜力相关的基因组特征）。通过 RAST、COG 和 GO 注释，研究人员检查了与植物定殖、植物防御激发、植物激素相关代谢和植物生长促进相关的基因。BX77 基因组含运动、趋化、生物膜形成和胞外基质产生相关基因，包括调控基因 spo0A、sinR/sinI、abrB，基质相关基因 tasA、tapA、sipW、epsA–O，群集运动和运动基因 swrA–C、motAB，以及多个趋化和鞭毛基因；这些提示其具有表面附着和植物定殖的基因组潜力，但本研究未实验评估这些功能。基因组还含可能参与植物生长促进的代谢途径基因，包括色氨酸生物合成基因 trpA–E、spe 家族多胺相关基因、acetoin 和 2,3-butanediol 代谢相关 alsS、alsD、alsR、bdhA，以及多个磷酸盐和氮获取与代谢基因。此外，BX77 基因组含132个预测 CAZymes，包括糖苷水解酶、糖基转移酶和碳水化合物结合模块，可能参与植物源和真菌源多糖的降解或修饰。
讨论部分总结：比较基因组分析确认 BX77 属于 B. velezensis，该物种具有广泛生物防治潜力和植物相关环境定殖能力。系统发育将其置于 Clade D，与具有多样抗菌活性的菌株聚在一起。比较基因组显示其具有该物种典型抗菌生物合成谱的高度保守性，同时具有菌株特异附属基因和基因组岛，可能促进生态适应和代谢多样化。另一个关键发现是 BX77 的抗 Salmonella 表型强烈受培养基组成影响：在常规实验室培养基中胞外抗 Salmonella 活性有限，而在苜蓿芽苗提取物中可诱导分泌使病原体完全失活的胞外代谢物。SE 含碳水化合物、有机酸、矿物质、酚类化合物和多种植物代谢物，这些物质既可作营养，也可作为环境信号。LBGM 仅产生延迟且部分抗 Salmonella 活性，说明仅促进生物膜形成不足以驱动强抗菌表型，该表型似乎更依赖芽苗提取物的植物源组成。转录组显示 SE 诱导所有13个 BGC 区域转录重塑，18 h 总体反应最强，而胞外抗菌活性24 h 后才可检测并于48–72 h 达最大，提示转录激活先于代谢物生物合成、分泌和胞外积累。由于转录组不能证明代谢物产生、胞外浓度或单个代谢物贡献，因此应将其解释为多个生物合成途径在 SE 条件下被转录激活的证据，而非证明哪一种预测代谢物导致抗 Salmonella 表型。difficidin、bacilysin、bacillaene 和 macrolactin H 等编码具已知抗菌活性的代谢物，其中 difficidin 和 bacilysin 呈双相诱导，与 Salmonella 失活相关；但确切活性化合物仍需靶向代谢组研究。surfactin、fengycin 和 bacillibactin 的诱导可能反映更广泛的植物相关生态功能，如定殖、生物膜形成、持久性、营养获取和竞争，而不应被解释为直接导致 Salmonella 失活。低相似 BGC 在植物源条件下强激活，可能代表 BX77 具有超出当前已知 Bacillus 生物活性代谢物的代谢能力。安全性方面，BX77 基因组未发现已知毒素基因；其预测 ARGs 少于 FZB42、QST713 和 DSYZ，且缺少与 colibactin 产生和 fosfomycin 耐药相关的 clbA 和 fosB1，也缺少 tet(45)；但四株菌共享 qacG、qacJ、vanT、vanY，BX77 和 FZB42 还含 bcI。环境 vanT 和 vanY 同源物与临床万古霉素耐药基因簇相似性低，其是否存在功能仍需研究。
研究结论翻译：比较基因组分析将 Bacillus 菌株 BX77 归入 Bacillus velezensis 种。BX77 在植物源环境中生长与早期（18 h）所有预测 BGC 中基因的广泛转录激活相关，该激活早于胞外抗 Salmonella 表型的发展。将这些表达数据与所诱导途径的已知功能整合，提出如下假设：若干生物活性代谢物可能共同参与抗 Salmonella 表型。其中一些 BGC 也可能支持 BX77 在植物环境中的生态适应。因此，该研究提供了一个联系基因组潜力、环境调控、BGC 表达和胞外病原体抑制的框架。未来需要代谢组学、遗传学和安全研究来鉴定活性化合物，并验证 BX77 作为安全有效生物防治剂以提高新鲜农产品安全性的应用潜力。
