乳酸菌（LAB）发酵作为番茄渣（TP）蛋白提取策略：替代蛋白的功能特性与安全性评价

《Food Chemistry Advances》：Lactic Acid Bacteria Fermentation as Protein Extraction Strategy: Functional Properties of Alternative Protein Obtained from Tomato Pomace

　　

番茄（Lycopersicon esculentum L.）加工工业是全球食品生产中最重要的部门之一，产生大量番茄渣（tomato pomace, TP），可通过创新、生态友好的微生物过程提取蛋白质加以利用。在本研究中，研究人员利用三株乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）发酵从TP中提取蛋白质。结果表明，LAB发酵提取蛋白质显著优于（p < 0.05）传统化学处理。Lactiplantibacillus plantarum PQ475926获得最高蛋白质含量（70.49%）和蛋白质回收率（31.39%）。发酵提高了发酵蛋白样品的功能特性。发酵后颜色参数增加，总酚含量和类黄酮增加，表现为2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）自由基清除。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的结构分析显示样品间蛋白质条带模式相似，轻微释放表明细菌发酵蛋白发生部分降解而未裂解。氨基酸分析显示所有处理均保留必需氨基酸。重金属评估证实发酵显著降低（p < 0.05）重金属水平。这些发现表明LAB发酵是从TP中提取蛋白质的有效且可持续方法，适合食品应用。

研究背景与问题：全球食品废物每年超过1.3×10⁹吨生物质，估计占人为温室气体排放8–10%。在循环经济策略中，从食品工业副产物回收蛋白有助于满足全球蛋白需求增长，并与消费者向植物基蛋白来源转变趋势并行。番茄工业加工产生大量副产物，全球TP产量估计为5.4×10⁶至9.0×10⁶吨/年，约占加工生物质3–5%（w/w）。TP积累和处置因体积、腐败和潜在环境影响成为加工部门的重要问题。TP主要由番茄皮和残渣组成，约占60%种子和40%皮，富含番茄红素、膳食纤维和脂质；TP粉营养特性包括必需脂肪酸和氨基酸、番茄红素、类黄酮、酚酸、类胡萝卜素及维生素A、C、E。传统蛋白提取方法包括热法和化学法，依赖碱、有机溶剂和酸，虽易操作，但存在溶剂用量大、提取时间长、提取率低等缺点。高温、高碱或高酸条件可影响蛋白热、结构和功能性质，降低营养价值并导致生物活性化合物降解。例如碱提后等电点沉淀有时需高pH和加热，导致赖氨酸和半胱氨酸等必需氨基酸损伤和部分水解，并形成不溶性蛋白聚集体，限制凝胶和乳化功能。超声提取可诱导自由基形成和氧化反应，损害蛋白质量且设备维护成本高；微波辅助提取可能因过度加热导致氨基酸降解或有害化合物生成。因此，需开发可持续、环境友好且在较温和条件下释放蛋白并保持功能特性的提取方法。LAB近年受关注，可通过发酵增强植物蛋白提取，其细胞壁分解作用促进蛋白溶解。已有报道Lactiplantibacillus plantarum PQ475926、Lactococcus lactis PQ475927和Pediococcus pentosaceus PQ475928可有效处理锦葵叶蛋白提取。LAB具有酸化和酶活性等生化特性，符合可持续绿色实践。用Bifidobacterium thermophilum发酵TP可显著增加肽含量至49.18%；番茄籽粕用Lactobacillus发酵可改善提取蛋白技术功能。但LAB发酵在植物基蛋白配料中虽广泛研究，在TP蛋白提取中应用仍有限。以往番茄副产物研究主要关注发酵的组成或技术功能结果，未比较发酵过程与直接乳酸诱导蛋白沉淀，因此LAB发酵对蛋白回收和功能性的效果在多大程度上来自微生物活动本身尚不清楚。缺乏比较数据评估生物酸化对TP提取蛋白的蛋白含量、蛋白回收率、功能性质和生物活性成分的差异影响。据研究人员所知，尚无研究全面评估使用LAB作为生物技术策略提取TP蛋白并与直接乳酸沉淀（lactic acid precipitation, LAP）作为非生物对照处理。本研究旨在评估细菌菌株、LAB在TP悬浮液中生长、酸化动力学、蛋白含量、蛋白回收率、功能特性（溶解度、水持力WHC、油持力OHC、起泡能力FC、起泡稳定性FS、乳化能力EC、乳化稳定性ES）、理化属性（颜色、SDS-PAGE、氨基酸谱）以及提取蛋白质量和安全性（总酚含量TPC、总黄酮含量TFC、抗氧化能力和重金属）。该工作提供定量基准数据，评估LAB发酵作为有前景生物过程增强蛋白提取和改善TP蛋白功能质量，用于食品系统潜在应用。

研究人员开展的研究与结论：研究人员用三株LAB发酵提取TP蛋白，并与LAP比较。结果表明LAB发酵显著优于传统化学处理；Lp. plantarum PQ475926蛋白含量最高（70.49%），蛋白回收率最高（31.39%）。发酵改善功能特性，增加TPC、TFC和DPPH自由基清除，SDS-PAGE显示条带模式相似并有轻微释放，氨基酸分析显示所有处理保留必需氨基酸，重金属水平显著降低。LAB发酵是有效、可持续、适合食品应用的TP蛋白提取方法。

关键技术与方法：样本来源为埃及Assiut Governorate番茄加工厂2024年番茄季（2024年6月至10月）TP。TP经40°C干燥、研磨过0.5 mm筛。三株LAB为Lactiplantibacillus plantarum PQ475926、Lactococcus lactis PQ475927和Pediococcus pentosaceus PQ475928。TP悬浮液按1:10（w/v）制备，72°C巴氏杀菌15 s，冷却至40°C，25°C搅拌16 h，接种5%（v/v）LAB，39±1°C发酵48 h，监测OD₆₀₀、pH和乳酸。对照包括未接种TP、热灭活LAB和LAP（1 mol/L乳酸调pH至4.0）。发酵后过滤、离心、沉淀、洗涤、调pH 7.0并冻干。部分实验在5 L生物反应器中进行，工作体积2 L，39±1°C，200 rpm，无通气，pH连续监测但不主动调节。分析包括Kjeldahl蛋白、蛋白回收率、功能性质、颜色、SDS-PAGE、TPC/TFC、DPPH、氨基酸HPLC和ICP-OES重金属，统计采用ANOVA及Tukey检验。

研究结果：
3.1 番茄渣粉的近似组成：测定显示TP粉水分5.91±0.82%、蛋白20.69±0.37%、脂肪4.88±0.52%、灰分3.30±0.17%、总碳水化合物71.13±0.89%、热值411.2±0.42 kcal/100g。水分反映干燥效果；高粗蛋白表明TP作为蛋白源的潜力，处于既往报道13.8–32.6%范围内。粗脂肪与报道值接近，因此研究认为无需脱脂，减少加工步骤和溶剂使用，使方法更环保；亚油酸和油酸增强提取蛋白功能价值。总碳水化合物与报道一致。数据表明TP是营养丰富副产物，具有食品、饲料和营养保健品增值潜力。
3.2 酸化动力学：监测48 h pH和乳酸产生，酸化约24 h接近平台，因此选24 h进行主要提取。三株LAB均能将pH降至约4.0。L. lactis PQ475927和P. pentosaceus PQ475928滞后约6 h进入对数期，约18 h达稳定期；Lp. plantarum PQ475926约3 h进入对数期，约22 h达稳定期，酸化效率和生长速率最高。未接种TP和热灭活LAB样品pH和乳酸基本稳定，证实无活菌时底物不自发酸化，灭活菌体不足以降低pH，排除被动酸释放或残留酶活，说明pH下降由活跃微生物代谢驱动。
3.3 发酵对蛋白含量和蛋白回收率影响：发酵显著提高（p < 0.05）蛋白含量和蛋白回收率。Lp. plantarum PQ475926蛋白含量最高70.49%，其次L. lactis PQ475927 53.69%、P. pentosaceus PQ475928 48.78%。蛋白回收率中Lp. plantarum PQ475926和L. lactis PQ475927最高（31.39%和26.66%，无显著差异），P. pentosaceus PQ475928显著较低（25.29%）。Lp. plantarum PQ475926优越性能可能归因于其蛋白水解系统和代谢活动，增强细胞壁降解和蛋白释放。LAB显著高于热灭活LAB，表明活跃微生物代谢驱动蛋白回收改善。
3.4 发酵对蛋白功能特性影响：
3.4.1 溶解度：LAB发酵蛋白溶解度显著不同（p < 0.05），Lp. plantarum PQ475926为69.30%，L. lactis PQ475927为66.96%，P. pentosaceus PQ475928为54.65%，LAP最低19.38%。改善可能与酶水解和部分结构破坏有关，SDS-PAGE评估了水解度和结构变化。发酵提供可测量优势，增强蛋白功能。
3.4.2 WHC和OHC：WHC范围为2.37–3.54 g/g，Lp. plantarum PQ475926最高，反映菌株依赖性。差异可能归因于LAB蛋白水解系统；Lp. plantarum PQ475926有5条SDS-PAGE条带，亲水氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸增强水结合。LAP最低WHC为1.5 g/g，因非生物酸化至等电点诱导电荷中和和紧密聚集，无蛋白水解活动。OHC方面，LAB为1.54–2.48 g/g，LAP为0.3 g/g；Lp. plantarum PQ475926最高2.48 g/g，超过商业大豆、蚕豆、扁豆和豌豆蛋白分离物范围。增强脂质结合由部分蛋白水解暴露疏水氨基酸侧链如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸解释。LAB提取蛋白可能适合需油保持和稳定的食品系统。
3.4.3 起泡性：发酵蛋白FC为25.03–26.00%，三株LAB间无显著差异（p > 0.05）；LAP较低20.43%。TP LAB提取蛋白FC相对较低，与长时间发酵导致疏水基团过度暴露、降低蛋白迁移至空气-水界面能力一致。FS为50.17–60.20%，LAP无FS，LAB菌株间无显著差异（p > 0.05）。该结果高于传统碱提、微波辅助和超声辅助提取的TP蛋白FS约35–38%。发酵增强FS，归因于部分展开蛋白形成粘弹性和内聚界面膜。LAP无FS可能因直接酸化导致过度聚集和快速泡沫塌陷。
3.4.4 乳化性：LAB发酵EC为200–205%，ES为94.73–97.56%；LAP最低EC为190%、ES为85%。Lp. plantarum PQ475926显著高于L. lactis PQ475927和P. pentosaceus PQ475928，后两者无显著差异。Lp. plantarum PQ475926最高EC/ES可能因发酵改善蛋白分子分散，增强界面吸附和乳化效率。EC落在既往奇亚蛋白浓缩物报道范围内。发酵可能主要通过微生物蛋白酶水解蛋白为短肽，增加两亲性和溶解度，增强乳化特性。
3.5 颜色特性：用L*、a*、b*和总色差ΔE*评估。LAP蛋白亮度L*高于LAB样品；LAB发酵导致L*降低，颜色相对更深，归因于结构变化和色素-蛋白相互作用促进番茄红素保留和周转。黄度b*最高在Lp. plantarum PQ475926发酵蛋白，可能因酶活影响色素转化和氧化反应。红度a*最高也在Lp. plantarum PQ475926，与TPC和TFC相关，突显酚类化合物增强红色。LAB与LAP样品ΔE*有显著差异（p < 0.05），最高ΔE*与LAP相关。LAB发酵通过酶和代谢途径改变颜色，LAP由pH下降驱动理化变化。提取蛋白可用于增强水果酸奶、蛋白强化酸奶饮料和植物基肉替代品颜色。
3.6 SDS-PAGE：未处理TP显示63、43和24 kDa主要条带，43 kDa可能对应番茄种子储存蛋白。LAP提取蛋白显示约67、65、45和27 kDa条带。P. pentosaceus PQ475928提取物显示约68、64、49和26 kDa片段；L. lactis PQ475927显示约67、63、47和25 kDa四条带；Lp. plantarum PQ475926检测到约66、63、45、30和27 kDa五条带。发酵样品中某些条带消失或减弱，低分子量条带出现，可能反映蛋白溶解度、分子量分布和结构改变。三株菌显示不同电泳模式，P. pentosaceus PQ475928中间分子量条带相对较强，而Lp. plantarum PQ475926和L. lactis PQ475927更有利。这些电泳变化可能部分解释功能性质。
3.7 总酚、类黄酮和抗氧化活性：LAB发酵显著增强与蛋白级分相关的酚类和类黄酮提取及抗氧化活性。Lp. plantarum PQ475926的TPC最高12.38 mg GAE/g，其次L. lactis PQ475927 11.42、P. pentosaceus PQ475928 10.95，LAP显著低6.69 mg GAE/g。TFC中Lp. plantarum PQ475926为1.38 mg QE/g，L. lactis PQ475927为0.64 mg QE/g，显著超过LAP 0.12 mg QE/g。DPPH清除中，Lp. plantarum PQ475926最强3.39 mgTE/g，L. lactis PQ475927为3.33，P. pentosaceus PQ475928为2.17，LAP为1.33 mgTE/g。改善主要归因于LAB水解酶将复杂酚类转化为更简单、更生物可利用形式。LAB发酵比LAP更有效增强功能特性。
3.8 重金属：ICP-OES定量TP蛋白提取物中Cd、Ni、Pb和As。所有LAB发酵蛋白中Cd和Ni低于检测限（0.0002和0.0010 mg/kg）；Pb和As相对对照显著降低（p < 0.05）。LAB发酵显著低于LAP，可能因LAP缺乏活性金属结合机制。LAB具有还原重金属离子能力，细胞壁肽聚糖和脂磷壁酸阴离子功能团可通过静电相互作用和螯合结合金属阳离子，与Pb和As降低一致。
3.9 氨基酸含量：TP含14–25%粗蛋白和平衡必需/非必需氨基酸，包括高水平Glu和Asp。比较发酵与直接乳酸酸化对照，氨基酸谱显示处理间差异。Glu在LAB发酵蛋白中特别丰富：Lp. plantarum PQ475926为55.80 mg/g，P. pentosaceus PQ475928为40.09 mg/g，L. lactis PQ475927为39.97 mg/g，LAP对照为38.29 mg/g。Leu和Val增加可能归因于LAB细胞包膜蛋白酶对疏水蛋白结构域的优先切割。Arg和Lys等带正电必需氨基酸在各菌株中不同程度升高，Lp. plantarum PQ475926通常Arg水平较高。发酵产生独特氨基酸谱，对生物活性和功能应用有潜在意义。

讨论与结论：讨论表明LAB发酵在多方面优于LAP，包括蛋白含量、回收率、功能性质、酚类/黄酮/抗氧化活性和重金属降低；LAP更简单快速，但蛋白产量、效率和污染物去除较低。研究结论翻译为：本研究证明LAB发酵是改善TP蛋白浓缩物提取和功能特性的有前景策略。在测试LAB菌株中，Lp. plantarum PQ475926蛋白含量最高70.49%，PRY最高31.39%，相比LAP的46.45%蛋白含量和22.97% PRY。发酵改善功能特性，尤其WHC、起泡和乳化。此外，发酵蛋白具有更高TPC、TFC和DPPH自由基清除活性。氨基酸分析显示总体氨基酸组成在各处理间基本一致。LAB发酵降低重金属含量。相反，直接乳酸酸化提供更简单快速蛋白提取，但导致相对较低蛋白产量、较低效率性能和较少污染物去除。总体，LAB发酵是将番茄加工副产物转化为高质量蛋白的有前景的环境友好、可持续和多功能策略。这些发现有助于实现其开发功能食品配料的潜力，减少农业废弃物并实现盈利回报。未来研究应评估TP蛋白在食品产品中的应用并研究其在工业加工条件下的技术性能。