基于滚环扩增信号放大与机器学习辅助的三明治型双模式分裂适配体传感器用于同时检测腹泻性贝类毒素

《Food Chemistry》：A RCA-based signal amplification and machine learning-assisted sandwich-type dual-mode split aptamers sensor for the simultaneous detection of diarrhetic shellfish toxins

　　

•构建了一种双模态拆分适配体传感器（DMSAS），用于检测腹泻性贝类毒素（DSTs）。•滚环扩增（RCA）与机器学习（ML）数据融合实现了超灵敏检测。•基于机器学习的双模态融合检测限（LOD）达到3.383 fg/mL（n = 6）。•在模拟样品中，机器学习模型分类准确率达100%。•在贝类样品中回收率为88.9%–103.1%。引言近年来，海洋污染加剧和有害藻华频发导致贝类产品严重受到海洋生物毒素污染，降低了海产品质量并威胁海洋食品安全（Wang et al., 2024; Weng et al., 2024）。腹泻性贝类毒素（DSTs）是一类由膝沟藻属（Prorocentrum）和甲藻属（Dinophysis）藻类产生的脂溶性多环醚生物活性毒素，主要包括石房蛤毒素（OA）、膝沟藻毒素-1（DTX-1）和膝沟藻毒素-2（DTX-2）（Suzuki & Quilliam, 2011）。DSTs常在贝类中积累（Matsushima et al., 2018）。人类摄入DSTs后，已引发多起大规模中毒事件，临床症状包括呕吐、恶心和腹泻（Marzidov?ek et al., 2024）。DSTs的主要中毒机制是抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶活性，诱导小肠上皮细胞腹泻性退化。这最终促进肠细胞分泌水分、氯离子和碳酸盐，同时抑制钠离子的正常吸收，从而导致水样腹泻（Ishihara et al., 1989）。此外，DSTs被确认为DNA加合物，可诱导DNA修复过程的调控，导致一系列细胞紊乱，包括细胞周期改变、凋亡和氧化损伤（Valdiglesias et al., 2010）。长期食用受DSTs污染的贝类已被证明可显著增加癌症风险（Van Acker et al., 2021）。除对公共健康的威胁外，DSTs污染还导致渔业关闭和海鲜产量下降，造成巨大的经济损失。据报道，DSTs超标1%与贝类产量下降0.66%相关（Martino et al., 2020）。因此，开发快速、高效和超灵敏的DSTs同时检测方法已成为确保公共健康和海洋食品安全的迫切需求。迄今为止，DSTs的检测方法主要可分为三类：不依赖生物识别元素的化学方法，包括高效液相色谱法（HPLC）（Lee et al., 2022）和HPLC-质谱联用法（HPLC-MS）（Ahuja et al., 2023）；以抗体作为生物识别元素的免疫检测方法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）（Pan et al., 2017）和胶体金免疫层析法（Ambrosi et al., 2010）；以及以适配体作为生物识别元素的适配体生物传感技术（Saleem et al., 2026; Wang et al., 2022; Wang et al., 2023）。尽管化学方法具有较高的灵敏度和准确性，但由于检测时间长、操作复杂和成本高等明显局限性，不适合常规监测（Wang et al., 2023）。免疫检测法相对简单且应用广泛；但在抗体制备、成本和重复性方面存在局限性。此外，表面增强拉曼散射（SERS）利用SERS活性基质放大微弱拉曼信号，近年来已应用于DSTs的灵敏和特异检测（Saleem et al., 2026）。值得注意的是，免疫检测法和适配体传感器均依赖于生物识别元素与靶标之间的特异性结合。与抗体相比，适配体具有合成简便、易于修饰、方便固定、构象灵活和化学稳定性好等优势（Yan et al., 2019; Zhao et al., 2022）。然而，基于适配体的传感技术开发中仍面临若干挑战。为解决非特异性二级结构导致的假阳性问题以及传统"单点结合"模式难以构建夹心型传感器的问题，本研究组先前利用拆分适配体（SAPs）开发了一种夹心型显色适配体传感器，实现了对OA、DTX-1和DTX-2的同时检测（Liu, He, et al., 2026）。然而，该显色适配体传感器的信号放大能力有限。此外，单信号输出检测模式在复杂基质中易受背景干扰，难以实现痕量毒素的准确定量。因此，在保持SAPs高特异性识别优势的同时，亟需引入更高效的信号放大策略和多信号输出检测模式。为克服单信号输出的局限性，整合多种识别元素和信号读出方式的双模态传感器在食品安全分析中引起了越来越多的关注。例如，Hu等人（2025）开发了一种利用适配体功能化碳点和金属有机框架的AFB1荧光/显色双模态检测夹心型传感平台，有效减少了复杂样品基质的干扰。Wang, Wang等人（2026）进一步引入比率荧光策略，构建了自校准双信号传感器，通过荧光和显色信号之间的相互验证提高了复杂样品检测的可靠性。这些研究表明，整合多种识别元素和信号读出方式可提高复杂基质中检测的选择性和可靠性。因此，在保留SAPs高特异性识别能力的基础上，融入更高效的信号放大策略和多模态信号读出方式，是提高DSTs痕量水平检测的重要策略。滚环扩增（RCA）作为一种等温扩增方法，因其显著的信号放大能力而被认为是提高检测灵敏度的理想方案（Liu et al., 2023）。迄今为止，RCA已成功应用于目标分析物的痕量检测（Gan et al., 2025; Wei et al., 2026），在生物传感领域展现出良好的应用前景（Feng et al., 2025; He et al., 2025）。RCA是一种稳健的DNA扩增策略，以环状DNA为模板，由聚合酶催化引物延伸，生成包含数百至数千个串联重复序列的长DNA产物（Han et al., 2025）。RCA的主要优势在于反应设计多样性高且对反应条件适应性好（Han et al., 2025）。通过将RCA与SAP介导的夹心型识别系统偶联，可将单次靶标结合事件转化为大量重复DNA序列的生成，从而实现检测信号的显著放大。在此基础上，本研究进一步将RCA信号放大与双荧光/显色信号输出相整合，以克服单信号检测对环境干扰的敏感性，从而提高复杂样品中的检测灵敏度和抗基质干扰能力。该双模态传感器有望通过信号交叉验证降低假阳性风险，同时拓宽检测动态范围，从而对具有复杂背景基质的测试样品展现出更强的适应性和可靠性。值得注意的是，双模态传感策略的引入使得可从经过相同前处理程序的样品中获得两种不同类型的光学信号，即荧光信号和显色信号，从而增加了数据维度与信息复杂度（Wang, Xu, et al., 2026; Yang et al., 2025）。然而，多源或高维数据的处理已超出传统单变量标准曲线拟合法直接数据处理能力，该方法难以充分挖掘双模态信号之间的内在相关性和协同信息。因此，亟需引入更先进的数据处理方法以充分发挥双模态传感器的优势。机器学习（ML）算法，特别是随机森林（RF）、线性判别分析（LDA）和支持向量机（SVM）等有监督学习模型，具有强大的模式识别和多变量非线性拟合能力，能够从复杂高维信号数据中提取潜在模式并建立定量相关性（Jiang et al., 2026; Su et al., 2025）。近年来，机器学习在食品安全领域（Chen, Liu, et al., 2024; Xu et al., 2025）和疾病诊断领域（Jiang et al., 2026; Zhang et al., 2025）获得了广泛关注，并在辅助多模态传感器快速识别药物类型和浓度方面取得了重要突破（Jiang et al., 2026; Wang et al., 2025）。值得注意的是，近期研究进一步将机器学习引入双模态传感平台，利用智能手机获取多维色彩信息并通过支持向量回归（SVR）进行分析，实现了农药残留的智能定量分析，展现了机器学习从多信号响应中提取潜在信息、增强双模态传感平台数据处理能力和实际应用潜力的前景（Zhao et al., 2026）。当集成到传感器数据分析中时，机器学习可通过训练集学习有效区分特异性响应和背景噪音，实现自动特征判别和信号优化。这不仅有助于提高毒素分类的准确性，还能实现更稳健的浓度定量回归，从而为解决复杂基质中同时检测的准确性问题提供先进策略（Jiang et al., 2026）。此外，机器学习能有效识别集合响应信号的细微差异，从而克服使用单模态传感器进行分析时因目标物结构相似性可能导致的交叉反应（Liu, Liu, et al., 2026）。基于上述分析，本研究在课题组先前建立的基于SAP的夹心识别系统基础上，进一步整合RCA信号放大、荧光/显色双模态输出和基于机器学习的智能数据分析，构建了一种新型夹心型双模态拆分适配体传感器（DMSAS），旨在为DSTs的大规模超灵敏筛查提供创新性解决方案。具体而言，首先筛选出可特异性识别DSTs的SAPs（SAP-1/SAP-2）（Wang et al., 2023），然后基于SAP-2依次设计了连接探针（LPR）和锁探针（PLP）。利用T4 DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶启动RCA反应，产生包含大量串联重复序列的RCA产物（RCAP）。基于本组先前工作（Liu et al., 2026b），构建了靶向DSTs的新型夹心识别结构（SAP-1–DSTs–RCAP）。随后，利用标记5(6)-羧基荧光素（FAM）的荧光探针（FP）和标记生物素（Bio）的显色探针（CP），设计了可分别输出荧光信号和显色信号的双模态检测系统。最后，将双模态检测系统收集的响应数据用于构建数据集，并通过机器学习建立多毒素识别模型，随后验证其灵敏度、特异性和抗干扰能力，并利用加标贝类样品进行实用性评价。本研究旨在建立基于拆分适配体传感系统的分子识别驱动多模态数据融合框架，整合分子识别、信号放大和智能模式识别。所提出的框架为小分子检测提供了一般性策略。材料与方法的详细信息提供在补充材料中。特别是，对于荧光检测模式（FDM），分别测量了不含DSTs的空白对照样品（记为F0）和含DSTs的实验样品（记为F1）的荧光强度，并计算荧光强度差值（ΔF = F1 ? F0）以评估信号响应。对于显色检测模式（CDM），测量450 nm处的吸光度值。DMSAS原理本研究设计了利用SAPs结合RCA实现DSTs超灵敏识别的新型DMSAS。DMSAS的工作流程可分为三个阶段：RCA信号放大、信号感知与识别、传感器性能分析。在第一阶段RCA信号放大中（图1A），筛选出一对可特异性识别DSTs的SAPs（即SAP-1和SAP-2）（Wang et al., 2023），其中SAP-2被设计嵌入到序列中……结论本研究通过整合RCA信号放大、荧光/显色双模态输出和基于机器学习的智能数据分析，构建了一种新型基于SAP的DMSAS，旨在实现DSTs的超灵敏同时检测。首先基于SAPs设计了连接探针（LPR）和锁探针（PLP），由此建立RCA以生成包含大量重复序列的RCAP。随后，构建了可识别DSTs的夹心识别结构（SAP-1–DSTs–RCAP）。作者贡献声明Yifei Liu：撰写—初稿、方法论、调查、形式分析、数据整理、概念构思。Chunyun Zhang：撰写—审阅与编辑、监督、资源。Mengyuan Yuan：调查、形式分析、概念构思。Xinlu Ma：可视化、形式分析、概念构思。Yuanyuan Wang：监督、形式分析、概念构思。Changlu Guo：监督、形式分析、概念构思。

陈国富：写作—审阅与编辑、监督、项目管理

**利益冲突声明**

作者声明不存在任何可能被认为会影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

**致谢**

本工作得到以下基金支持：国家自然科学基金（编号：42377422）、山东省自然科学基金（编号：ZR2023MD085 & ZR2025MS583）、哈尔滨工业大学科研创新基金（编号：2022KYCXJJ07）以及哈尔滨工业大学"双一流"学科建设基金（编号：2023SYLHY06）。

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