《Food Chemistry: X》：Integrated sensory evaluation and feature-based molecular networking elucidate flavor improvement and associated metabolites in dark tea fermented by
Eurotium cristatum and
Bacillus coagulans
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本研究采用整合方法，将人类感官评价、电子舌分析与基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的特征分子网络（FBMN）相结合，系统分析了经不同微生物菌株发酵的六堡茶（LPT）。风味评价结果表明，微生物发酵菌株显著改善了LPT的风味特征。FBMN方法实现了微生物来源代谢
本研究采用整合方法，将人类感官评价、电子舌分析与基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的特征分子网络（FBMN）相结合，系统分析了经不同微生物菌株发酵的六堡茶（LPT）。风味评价结果表明，微生物发酵菌株显著改善了LPT的风味特征。FBMN方法实现了微生物来源代谢物的快速、全面鉴定，有助于阐明发酵过程中发生的化学转化。随后进行统计分析，以鉴定不同菌株发酵的LPT样品间的关键差异代谢物。此外，系统评估了微生物代谢物与感官属性之间的关系，以阐明它们各自对风味增强的贡献。基于这些发现，研究人员提出了负责特征风味化合物形成的潜在微生物代谢途径。研究发现，冠突散囊菌（Eurotium cristatum）发酵显著提高了LPT的甜度并降低了苦味，而凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）则增强了陈化风味。FBMN分析共鉴定出358种化合物，包括10种潜在的新型乙基吡咯烷酮取代的黄烷-3-醇B环裂解类似物（eps-FBRFAs）。相关性分析揭示，冠突散囊菌诱导的FBRFAs、eps-FBRFAs和非酯型儿茶素的增加与甜味增强显著正相关，而酯型儿茶素的减少与苦味降低相关。分子对接进一步提示，FBRFAs和eps-FBRFAs可能通过与甜味受体TAS1R2/TAS1R3相互作用而影响甜味感知，但其直接甜味活性仍需进一步功能验证。凝结芽孢杆菌发酵主要促进茶叶蛋白质向线性肽的蛋白水解转化，这些肽与特征陈化风味密切相关。总体而言，该研究从化学和感官两个角度阐明了微生物发酵在LPT风味形成中的关键作用，鉴定了二次发酵过程中与风味变化相关的关键代谢物，为阐明黑茶二次发酵机制提供了有效策略。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
黑茶是一类经微生物渥堆发酵而成的后发酵茶，以其独特的陈化香气和甜醇滋味著称，这些风味特征主要源于复杂的微生物代谢活动。六堡茶（Liu-Pao tea, LPT）作为黑茶的代表性品类，凭借其独特的感官品质，于2022年被认定为中国最具影响力的茶叶品牌之一。六堡茶的加工方式总体上分为传统型和现代型两类，其核心区别在于是否涉及二次微生物发酵。传统加工通常仅涉及蒸压和陈化，往往因发酵不充分而导致产品汤色偏淡、光泽不足。相比之下，现代加工通过接种特定的优势微生物菌株进行可控的二次微生物发酵，旨在改善茶汤的色泽、香气和滋味。然而，这一现代方法的有效性和一致性高度依赖于微生物群落结构的稳定性，群落组成的变化可能导致产品质量不稳定并阻碍标准化进程。因此，策略性地筛选和合理应用特定微生物菌株来引导发酵过程，是推动六堡茶生产发展的重要途径。
在二次微生物发酵中，冠突散囊菌（Eurotium cristatum）作为著名的“金花”真菌，是一种强效益生菌，能够促进水杨酸甲酯和芳樟醇氧化物等特征性真菌香气的形成，赋予茶叶独特的“菌花”香并增强其健康功效。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）则是一种公认的益生细菌，其产生的蛋白酶和脂肪酶可催化蛋白质和脂质的水解，生成生物活性肽和脂肪酸衍生物。尽管这两种发酵菌株均已被确认为黑茶二次微生物发酵中的优势微生物，但它们影响风味化合物形成与转化的具体机制仍不清楚。因此，深入理解二次微生物发酵中的微生物代谢机制，特别是不同发酵菌株产生的差异代谢物如何影响风味，对于开发新型发酵菌株和提升六堡茶风味品质至关重要。
二、研究内容概述
本研究选取三株潜在益生菌株——冠突散囊菌（8730）、凝结芽孢杆菌（No. 10059）和凝结芽孢杆菌（JZ-1），对传统六堡茶进行二次微生物发酵，制备新型六堡茶产品。研究采用人类感官评价、电子舌分析和基于LC-MS的特征分子网络（FBMN）相结合的系统方法，对经不同微生物菌株发酵的六堡茶进行综合分析，旨在揭示不同发酵菌株对风味形成的贡献机制，鉴定关键差异代谢物，并阐明微生物代谢物与感官属性之间的关联。
三、主要技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：人类感官评价（参照中国国家标准GB/T 23776–2018，由6名经培训的评审员对甜味、鲜味、苦味、酸味、涩味和陈化风味6个感官属性进行10分制强度评分）；智能电子舌系统测试（采用SA-402B味觉传感系统定量分析9种味觉属性）；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UHPLC-Q-TOF/MS）进行非靶向代谢物分析；基于全球天然产物社会分子网络平台（GNPS）的特征分子网络（FBMN）分析实现代谢物的快速注释与可视化；主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）用于差异代谢物筛选；冗余分析（RDA）和相关性热图用于代谢物与风味属性的关联分析；分子对接（AutoDock Vina和PyMOL）用于评估代谢物与甜味受体TAS1R2/TAS1R3的结合亲和力。样本来源方面，六堡茶样品由中国茶叶科技有限公司（北京）提供，其中传统发酵产品作为预发酵原料，新型功能产品通过单一菌株在50°C条件下发酵7天获得。
四、主要研究结果
4.1 新型六堡茶的制备与特征分析
研究结果显示，不同微生物发酵菌株显著影响了六堡茶的形态外观和茶汤色泽。凝结芽孢杆菌发酵的茶叶颜色加深，茶汤呈深褐色；冠突散囊菌发酵的六堡茶呈现独特的“金花”外观，茶汤呈红棕色。人类感官评价表明，微生物发酵普遍提高了甜味和鲜味，同时降低了苦味，但不同菌株的变化幅度存在差异。其中冠突散囊菌（8730）组的变化最为显著，甜味评分从对照组的5.50升至7.50，鲜味从1.50升至3.75，苦味从4.25降至2.75。电子舌分析进一步验证了这些结果，冠突散囊菌发酵组的甜味值从传统六堡茶的3.654升至5.989，苦味值从3.484降至2.500。化学成分分析显示，凝结芽孢杆菌发酵导致总蛋白含量下降（JZ-1菌株组p<0.05）和多酚含量显著降低（p<0.01），而冠突散囊菌发酵组总蛋白含量显著增加（p<0.05），黄酮类化合物呈整体上升趋势，可溶性糖含量无显著差异。
4.2 基于LC-MS-FBMN策略的微生物代谢物发现与鉴定
研究人员应用LC-MS结合FBMN策略对六堡茶中的代谢物进行快速挖掘和注释，共获得18,342个质谱节点，注释涵盖黄酮类、氨基酸/肽类及其类似物、生物碱和核苷类、脂质等五大化学类别。共初步鉴定出358种化合物，包括10种潜在新化合物，涵盖249种黄酮类、21种肽类、6种氨基酸、32种脂质和50种生物碱或核苷类化合物。通过分析MS/MS碎片模式并利用结构相似性原理，研究人员鉴定了四类代表性化合物簇：簇1为黄烷-3-醇B环裂解类似物（FBRFAs），共注释20种，如teadenol A、planchol A、fuzhuanin A/B等；簇2为黄酮生物碱类，包括puerins I-IV、purines V-VIII和乙基吡咯烷酮取代的没食子儿茶素（eps-gallocatechin），并首次鉴定了一类新型化合物——乙基吡咯烷酮取代的FBRFAs（eps-FBRFAs），共注释10种，如eps-teadenol、eps-fuzhuanin B、eps-xanthocerin等；簇3和簇4主要为肽类相关节点，包括五肽Gly-Pro-Phe-Pro-Leu/Ile等16种线性肽，以及neoechinulin A、echinulin、tardioxopiperazine A等5种含吲哚环二肽。
4.3 微生物来源差异代谢物的鉴定
OPLS-DA分析显示，冠突散囊菌发酵组与传统六堡茶之间存在显著分离，共鉴定出71种差异化合物，其中33种显著上调、38种显著下调。上调代谢物主要归类为FBRFAs、eps-FBRFAs和非酯型儿茶素，其中9种FBRFA类化合物和3种eps-FBRFAs显著增加。值得注意的是，非酯型儿茶素（C、GC、EC、EGC）在冠突散囊菌发酵组中显著富集（p<0.0001），而酯型儿茶素（EGCG、CG、GCG、ECG）呈显著下降趋势，表明冠突散囊菌可能促进酯型儿茶素水解转化为非酯型形式。此外，3种异戊烯基环肽（neoechinulin A、echinuline、tardioxopiperazine A）在冠突散囊菌发酵组中显著积累（p<0.0001），这些特征性吲哚二酮哌嗪衍生物源于真菌次生代谢。凝结芽孢杆菌发酵组中，JZ-1菌株组鉴定出38种差异化合物（15种显著上调，包括4种氨基酸和11种肽），No. 10059菌株组鉴定出35种差异化合物（9种显著上调）。Venn图分析显示，No. 10059组的所有差异肽均存在于JZ-1组中，而JZ-1组另有8种独特肽。代表性肽类（Pro-Glu-Val、Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val、Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe）从对照组到两个凝结芽孢杆菌发酵组呈逐渐增加趋势，JZ-1组水平最高（p<0.0001），表明JZ-1菌株具有更强的蛋白水解活性。
4.4 风味相关微生物代谢物及潜在靶点的发现
冗余分析（RDA）显示RDA1和RDA2分别解释了84.74%和8.82%的总方差，表明这些化合物与风味特征变化密切相关。沿RDA1轴，甜味主要与非酯型儿茶素（EC、EGC、C、GC）、FBRFAs（如fuzhuanin B、teadenol A）和eps-FBRFAs（如eps-teadenol A、eps-xanthocerin、eps-fuzhuanin B）相关，而苦味和苦味回味（aftertaste-B）与酯型儿茶素（CG、ECG、GCG、EGCG）更密切相关。相关性分析表明，凝结芽孢杆菌发酵产生的低分子量线性肽与陈化风味属性呈正相关；冠突散囊菌发酵诱导的FBRFAs和eps-FBRFAs与甜味显著正相关。分子对接分析显示，8种FBRFAs和4种eps-FBRFAs均能与甜味受体TAS1R2/TAS1R3的关键结合口袋（由Tyr-103、Asp-142、Asn-143、Ser-165、Tyr-215和Asp-278六个氨基酸残基组成）发生相互作用，结合能范围为-7.1至-9.0 kcal/mol，其中11种代谢物与一个或多个关键残基发生相互作用，提示这些化合物可能具有调节甜味受体活性的潜力。
4.5 eps-FBRFAs的可能生成途径
研究人员首次在六堡茶中鉴定出新型eps-FBRFAs类化合物，且仅在冠突散囊菌发酵组中显著富集，表明该菌株在eps-FBRFAs的形成或积累中发挥重要作用。据此提出了可能的生物合成途径：首先，酯型儿茶素（如EGCG）转化为非酯型儿茶素（如EGC）；随后，EGC经历环过氧化物形成、间位双加氧酶裂解、双键还原、醛或内酯氧化和内酯化等一系列反应生成FBRFAs（如xanthocerin、fuzhuanin B、teadenol A/B等）；与此同时，茶氨酸经斯特雷克降解生成中间醛类化合物，进一步环化产生乙基吡咯烷酮；该中间体随后与FBRFAs在C-8位结合形成eps-FBRFAs。与这一推测一致，冠突散囊菌发酵组中茶氨酸含量显著下降，在所有组中降幅最大。
五、结论与意义
本研究通过感官评价与FBMN相结合的方法，系统揭示了二次微生物发酵在六堡茶风味形成中的关键作用。人类感官评价与电子舌分析的整合表明，冠突散囊菌发酵显著增强了六堡茶的甜味并有效降低了苦味，凝结芽孢杆菌则增强了陈化风味。FBMN分析共鉴定出358种化合物，包括10种潜在的新型eps-FBRFA类代谢物。相关性分析揭示，冠突散囊菌诱导的FBRFAs、eps-FBRFAs和非酯型儿茶素的增加与甜味增强显著正相关，而酯型儿茶素的减少与苦味降低相关。分子对接进一步提示FBRFAs和eps-FBRFAs可能通过与TAS1R2/TAS1R3相互作用而影响甜味感知，但其直接甜味活性仍需进一步功能验证。凝结芽孢杆菌发酵主要促进茶叶蛋白质向线性肽的蛋白水解转化，这些肽与特征陈化风味密切相关。该研究从化学和感官两个角度阐明了微生物发酵在六堡茶风味形成中的关键作用，鉴定了二次发酵过程中与风味变化相关的关键代谢物，为阐明黑茶二次发酵机制提供了有效策略，也为开发新型发酵菌株和提升六堡茶风味品质奠定了科学基础。
