年龄相关肿瘤突变负荷与炎症衰老：初治患者泛癌多组学中癌种与MSI状态的混杂效应

《Immuno-Oncology and Technology》：Age-related tumor mutational burden and inflammaging: a pan-cancer multi-omics study of treatment-na?ve patients

　　

微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high, MSI-H）肿瘤较非MSI-H肿瘤更显著放大肿瘤-正常组织炎症差异，校正后该差异增强。校正癌种后，正常组织炎症在蛋白质水平随年龄增加。年龄相关肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）增加并非独立于癌种和MSI状态。正常组织炎症与TMB的相关性在校正后未持续存在。免疫热（immune-hot）微环境仅见于老年（>60岁）患者，但癌种可解释该分布。

衰老是癌症发生的主要不可调控风险因素，癌症发病率随年龄增长而升高。“炎症衰老”（inflammaging）指与衰老相关的慢性、低度系统性炎症，其特征包括循环细胞因子升高、免疫细胞组成改变和持续炎症信号，并被视为包括癌症在内的年龄相关疾病的重要驱动因素。大规模基因组研究已记录TMB随年龄增加，这与体细胞突变随时间累积一致，并具有治疗意义，因为TMB可预测免疫检查点抑制剂反应。炎症与基因组不稳定之间具有双向关系：慢性炎症可诱导DNA损伤，而基因组不稳定的肿瘤可通过胞质DNA感知触发炎症反应。系统性炎症衰老是否促进年龄相关TMB增加仍为未决问题。TITANIA（mulTi omIcs daTa cANcer dIagnostics therApies）框架通过匹配多组学分析提供了研究年龄相关分子差异的机会。该框架采用可缩短冷缺血时间的样本处理方案，快速冷冻新鲜手术标本，以保留常规生物样本库中易丢失的分子信号。研究人员整合同一组织的全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）、转录组学和蛋白质组学，以表征肿瘤内在特征及可能不同于年轻与老年患者的微环境变化。本研究分析初治队列，包括六种癌症：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）、胃癌、肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）、非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）、卵巢癌和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。研究人员开展泛癌多组学分析，比较年龄≤60岁与>60岁患者，在转录组和蛋白质组水平表征基因组不稳定和炎症通路活性，并探索其与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）特征的关系。研究结果可能为未来按癌种分层的年龄相关肿瘤生物学研究提供信息。

研究人员开展的研究来自TITANIA项目，该研究为在日本国家癌症中心医院东院（National Cancer Center Hospital East, Kashiwa, Japan）与Indivumed GmbH（Hamburg, Germany）合作进行的前瞻性多组学注册研究，经机构审查委员会批准（批准号：2020-079），符合《赫尔辛基宣言》。所有患者提供书面知情同意。纳入标准为组织学确认的原发恶性肿瘤、既往无系统性抗癌治疗、以治愈为目的的手术切除，以及足够用于多组学分析的组织。六种癌种包括CRC、胃癌、RCC、NSCLC、卵巢癌和HCC。患者按手术时年龄60岁分层。主要基因组队列包括153例初治患者，中位年龄72岁，其中40例（26.1%）年龄≤60岁。癌种分布在年龄组间显著不同：年轻组富集卵巢癌，老年组富集NSCLC和胃癌。MSI-H肿瘤在132例可评估MSI状态患者中检出11例（8.3%），均>60岁，均发生于CRC（7例）或胃癌（4例）。匹配正常组织分析在无卵巢癌正常组织的情况下结构性限于其余五种癌种。研究结论显示，大多数表观年龄相关差异在很大程度上可由年龄组间癌种构成差异解释；校正后持续存在的发现为正常组织蛋白质水平炎症信号随年龄增加，以及MSI-H肿瘤较非MSI-H肿瘤更显著放大相对于自身正常组织的炎症。正常组织炎症与TMB的相关性未持续存在，不应解释为系统性炎症衰老驱动基因组不稳定的证据。该研究的重要意义在于，其匹配肿瘤-正常组织设计、严格冷缺血控制和初治人群有助于区分肿瘤内在与癌种相关差异，并提示检验炎症衰老假说需在单一肿瘤实体内部估计年龄效应。

关键技术方法概述（不超过250字）：样本队列来源于TITANIA前瞻性多组学注册研究，由National Cancer Center Hospital East与Indivumed GmbH合作，纳入初治手术患者，覆盖CRC、胃癌、RCC、NSCLC、卵巢癌和HCC。术中标准化采集肿瘤与匹配正常组织，冷缺血时间中位数12 min（IQR 10-14），肿瘤细胞含量≥30%、坏死≤30%。采用WGS，肿瘤平均覆盖≥60×、正常≥30×；rRNA去除RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）≥100 million reads；数据非依赖采集液相色谱-串联质谱（data-independent acquisition liquid chromatography–tandem mass spectrometry, DIA LC-MS/MS）蛋白质组学，DIA-NN 1.8.1处理。GRCh38比对，TMB、MSI状态和基因组改变分数（fraction of genome altered, FGA）由提供方计算，TitanCNA、CINmetrics和MSIseq辅助。ComBat-seq批次校正；fgsea进行Hallmark基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），GSVA进行单样本GSEA（single-sample GSEA, ssGSEA）；DESeq2和limma差异表达；xCell解卷积及k-means聚类；Kaplan-Meier、Cox和maxstat生存分析。

研究结果如下。

患者特征和数据可用性：153例初治患者中位年龄72岁，40例≤60岁，113例>60岁。癌种分布在年龄组间差异显著，年轻组富集卵巢癌，老年组富集NSCLC和胃癌；性别、分期、体重指数和冷缺血时间平衡。MSI-H肿瘤11/132，均>60岁，均见于CRC或胃癌。WGS突变数据覆盖153例，肿瘤RNA-seq覆盖132例，肿瘤蛋白质组覆盖137例，匹配正常RNA-seq覆盖61例，匹配正常蛋白质组覆盖81例。卵巢癌无匹配正常组织，因此肿瘤-正常比较限于五种癌种。

癌种特异性分子分析：研究人员首先检查突变景观，HCC因样本量小被排除。各癌种内年龄组间最高频突变基因大体一致，未发现经Benjamini-Hochberg校正后年龄组差异显著的基因；卵巢癌ARID1A名义结果最突出但未通过校正。差异表达和通路分析限于CRC、RCC和卵巢癌。卵巢癌差异表达基因最多（548），高于CRC（56）和RCC（55）；降采样后卵巢癌仍最多。Hallmark GSEA显示部分年龄相关模式跨癌种一致：CRC中老年患者富集IFN-γ反应、同种移植排斥和补体，年轻患者富集胰腺β细胞；卵巢癌中老年患者富集TNFα经NF-κB信号、氧化磷酸化、MYC靶点V1、缺氧、IL6-JAK-STAT3信号和同种移植排斥，年轻患者富集WNT/β-catenin信号；RCC中无通路校正后显著。

整合多组学ssGSEA分析：研究人员对全部50个Hallmark通路进行ssGSEA。层次聚类显示样本主要按癌种而非年龄组聚集；主成分分析在RNA和蛋白质水平均主要按癌种分离，未形成年龄组聚类。患者流程图显示MSI-H肿瘤主要流向高TMB。

年龄相关TMB增加：泛癌队列中TMB与年龄正相关（Spearman r_s=0.334，P<0.001），而FGA与年龄无关（r_s=0.05，P=0.54）。老年患者TMB显著高于年轻患者，中位TMB随年龄十年段逐步增加。癌种特异性分析显示RCC和CRC中年龄-TMB关联显著；连续年龄分析中RCC强（r_s=0.79），CRC中等（r_s=0.39），NSCLC和胃癌缺失，卵巢癌反向（r_s=-0.31）。多变量模型中，log₁₀(TMB)的年龄系数从未校正的每10年0.077（P=0.007）降至校正癌种后的0.059（P=0.034），再进一步校正MSI状态、性别和分期后为0.027（P=0.27）。MSI-H状态是最强预测因子（β=1.08，P<0.001，约12倍高TMB）。排除MSI-H未恢复年龄效应。结论是年龄相关TMB增加并非独立于肿瘤实体和MSI状态。

年龄相关炎症通路激活：炎症评分在肿瘤和正常组织中与年龄的关系被分析。肿瘤炎症与年龄在两个组学水平均呈弱正相关（RNA r_s=0.223，P=0.0091；蛋白质r_s=0.233，P=0.0054）。正常组织中，蛋白质水平相关显著（r_s=0.279，P=0.011），RNA水平未达显著（r_s=0.241，P=0.059）。按60岁切点，老年患者肿瘤组织RNA和蛋白质水平炎症评分更高，正常组织蛋白质水平炎症评分更高。校正癌种后，年龄与炎症评分的关联仅在正常组织蛋白质水平持续（β=0.0007/年，P=0.006），进一步校正MSI状态、性别和分期后仍显著（β=0.0008，95% CI 0.0003-0.0013，P=0.003，n=74）。六个Hallmark炎症通路中，仅正常组织蛋白质水平IL6-JAK-STAT3信号在其层内校正后存活。MSI-H状态与肿瘤组织蛋白质水平炎症较高相关，但与正常组织炎症无关。

校正后正常组织炎症与TMB：正常组织炎症与配对肿瘤TMB在蛋白质水平（r_s=0.387，P<0.001）和RNA水平（r_s=0.283，P=0.027）相关。仅校正年龄后蛋白质相关性略降（partial r_s=0.276，P=0.013）；仅校正癌种后消失（partial r_s=0.165，P=0.15）；同时校正两者后无关联（partial r_s=0.071，P=0.54）。RNA相关性表现类似，双向线性回归结果相同。癌种分层分析中，仅CRC在蛋白质水平保留显著相关（r_s=0.51，校正P=0.012，n=35）。因此，表观泛癌相关性反映不同肿瘤实体在典型TMB和起源器官炎症张力上的差异，而非实体内部一致关系；不支持系统性炎症衰老促进基因组不稳定。

MSI-H状态与炎症放大：MSI-H与非MSI-H肿瘤的正常组织炎症评分在RNA或蛋白质水平均无差异。然而，肿瘤-正常炎症差异（ΔInflammation=肿瘤-正常）在MSI-H肿瘤蛋白质水平显著更大（Wilcoxon P=0.016），RNA水平不显著。通路特异性分析显示，蛋白质水平IFN-α反应和TNFα经NF-κB信号更明显。在具有配对肿瘤和正常蛋白质组且MSI可评估的74例患者中，ΔInflammation差异未校正为0.065（P=0.015），校正癌种后增至0.087（P<0.001）；仅限CRC为0.076（P=0.005）。通路水平上，IFN-α反应、IFN-γ反应、TNFα经NF-κB信号和炎症反应在校正后仍显著。结论是MSI-H肿瘤在肿瘤区室放大炎症，而正常组织基线炎症无差异。

年龄相关通路变化的多组学一致性：研究人员比较所有Hallmark通路的RNA和蛋白质年龄效应。位于右上象限的通路在老年患者两个组学水平均显示一致较高评分。TNFα经NF-κB信号、IL6-JAK-STAT3信号、IFN-γ反应、炎症反应和同种移植排斥等炎症通路聚集于右上象限，显示两个水平正向年龄效应。该分析被视为一致性验证而非独立结果，因为两个组学层来自同一标本且非统计独立。

TME聚类：研究人员使用肿瘤RNA-seq的xCell细胞类型丰度进行k-means聚类，识别出三个TME亚型：免疫热、免疫冷和血管丰富。该三聚类解内部可重复，免疫冷簇bootstrap稳定性高（Jaccard 0.89），免疫热（0.75）和血管丰富（0.74）边界。将癌种回归去除后重新聚类，与原分配一致性降至校正兰德指数0.36，表明分类很大程度反映肿瘤实体。免疫热簇高浸润B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和M1巨噬细胞，中位TMB最高，且仅见于老年患者。免疫冷簇免疫细胞浸润耗竭，中位TMB最低。血管丰富簇内皮细胞和基质成分升高，TMB居中。14例免疫热肿瘤均>60岁，9例为NSCLC。二分类逻辑回归中，年龄每增加一年未校正比值比1.063（95% CI 0.997-1.134，P=0.060），校正癌种、MSI状态和log₁₀(TMB)后为1.026（95% CI 0.930-1.132，P=0.61）；多分类模型中仅癌种显著。TMB在簇间差异显著，与B细胞、中性粒细胞、M1巨噬细胞、CD4⁺ T细胞和总体免疫评分正相关，与内皮细胞、M2巨噬细胞和基质评分负相关。

预后通路分析：研究人员探索50个Hallmark通路的预后价值。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）通路在RNA（C-index 0.63）和蛋白质（0.61）水平C-index最高，风险比方向一致。Kaplan-Meier分析显示高EMT评分与较差无进展生存期（progression-free survival, PFS）相关：RNA水平HR 3.19（95% CI 1.51-6.71，log-rank P=0.0013），蛋白质水平HR 2.92（95% CI 1.39-6.12，P=0.0029），3年PFS率分别为82.5%对59.8%和81.7%对57.3%。但连续变量模型不显著：RNA每标准差HR 1.47（P=0.053），蛋白质1.36（P=0.11）；多变量模型分别1.50（P=0.059）和1.40（P=0.10），每变量事件数仅2.8和2.9。置换校正后log-rank P为RNA 0.026、蛋白质0.052。癌种特异性分析仅CRC和NSCLC可行，结果异质。该分析为假设生成，不声称独立预后价值。

敏感性分析：因HCC仅4例，所有主要回归、生存和聚类分析在排除HCC后重复。20个模型中仅一个显著性结论改变。MSI-H肿瘤的肿瘤-正常炎症放大未变；重新推导TME聚类完全重现原分区（校正兰德指数1.000）。

讨论部分总结：匹配肿瘤和正常组织、严格冷缺血控制及初治人群，使研究人员能够询问哪些年龄相关差异属于肿瘤，哪些属于肿瘤实体。未校正分析中，老年患者TMB更高，两个组学水平炎症通路活性更高；但癌种分布在年龄组间差异显著，校正癌种后多数差异明显衰减，而标准误未增加。持续存在的是正常组织蛋白质水平炎症信号随年龄增加，以及MSI-H肿瘤更大的肿瘤-正常炎症放大。老年患者TMB显著高于年轻患者，与既往大规模基因组研究一致，可能反映体细胞突变终生累积。本研究未观察到年龄与FGA相关。多变量模型中，TMB的年龄系数在校正癌种后减半，在加入MSI状态、性别和分期后失去显著性；这并不与更大规模、更平衡队列中的文献矛盾，但意味着本队列不能证明实体独立的年龄效应。正常组织炎症与配对肿瘤TMB的相关在校正前蛋白质水平显著，但校正癌种后消失，同时校正年龄和癌种后无关联，分层分析仅CRC保留。最简约解释是组成性：不同肿瘤实体在典型TMB和起源器官炎症张力上系统不同，合并后产生泛癌相关，而单个肿瘤实体内并不一致；因此数据不支持系统性炎症衰老导致基因组不稳定。MSI-H肿瘤正常组织炎症与非MSI-H相似，但肿瘤-正常炎症放大在蛋白质水平更大，校正癌种后增强，CRC内也显著，尽管样本少。MSI-H肿瘤因高新抗原负荷而具有更强瘤内炎症反应在生物学上可预期，本观察价值在于证明差异局限于肿瘤区室：匹配正常组织基线炎症不因MSI状态而异。横断面设计不能排除反向因果。细胞类型解卷积显示TMB与B细胞、中性粒细胞、M1巨噬细胞和CD4⁺ T细胞浸润正相关，与基质和内皮特征负相关，提示高TMB肿瘤倾向免疫浸润而非基质主导。免疫热分布在校正后主要由癌种解释：14例免疫热中9例为NSCLC，本队列中NSCLC几乎均为老年患者；校正后年龄与免疫热成员资格无独立关联。聚类内部可重复，但去除癌种效应后重新聚类仅弱再现原分区。六种癌种在检查点抑制常规实践程度方面差异显著，但本队列无患者接受检查点抑制剂，因此任何反应推断均为间接。局限性包括年轻患者样本量有限、横断面设计、癌种强混杂、年龄与MSI状态无法可靠分离、卵巢癌无正常组织、HCC仅4例、炎症评分未独立验证、生存事件少且多变量模型每变量事件数低于10。优势为匹配肿瘤-正常设计、严格组织处理和初治人群，使MSI-H炎症差异定位于肿瘤区室。

研究结论翻译：总之，这项匹配肿瘤-正常组织的多组学分析显示，在一个泛癌手术队列中，大多数表观年龄相关差异在很大程度上可由年龄组间癌种构成差异解释。校正后持续存在的两个发现是：正常组织中的炎症信号在蛋白质水平随年龄增加；MSI-H肿瘤相对于其自身正常组织较非MSI-H肿瘤更显著放大炎症。正常组织炎症与TMB之间的相关性未持续存在，不应被解释为系统性炎症衰老驱动基因组不稳定的证据。检验炎症衰老假说将需要足够大的队列以在单一肿瘤实体内部估计年龄效应。原文作者：S. Yajima|Y. Tsukada|Y. Sota|S.J.-Y. Ohtani-Kim|R. Yamashita|T. Fujisawa|T. Kuwata|G. Ishii|N. Gabelia|H. Juhl|S. Takasu|M. Takahashi|H. Bando|T. Yoshino|M. Ito|H. Masuda。