冷等离子体预处理失活脱脂大豆粉中脂氧合酶（LOX）和脂肪酶（LP）增强大豆分离蛋白（SPI）风味并调控其结构与功能特性

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Cold plasma-induced lipoxygenase and lipase inactivation for flavor enhancement: Implications on structural and functional properties of soy protein isolate

　　

脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）和脂肪酶（lipase, LP）介导的脂质氧化通过促进结构修饰、降低消化率并促使蛋白质氧化反应而削弱大豆蛋白的功能品质，从而限制其应用。该研究评估了脱脂大豆粉的干法（针-板，pin-to-plate, PP）和湿法（等离子体活化水，plasma-activated water, PAW）预处理对酶失活以及所得大豆分离蛋白（soy protein isolate, SPI）结构、功能和风味特性的影响。提取蛋白中残留LOX活性降至54.70%（PP30）和81.10%（PAW30），LP活性分别降至57.89%和65.67%。挥发性风味谱显示，PP30蛋白中豆腥味和青草味（醛类）挥发性化合物浓度较低，而PAW30中果香和奶油香化合物（酮类和醇类）浓度较高，可能归因于活性物种介导的氧化。尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）分析显示，高分子量聚集体（>100 kDa）从69%增至84%和86%，低分子量组分（<5 kDa）也增加。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析表明，仅PP30通过降低α:β比发生二级结构重排。PP30还显示比PAW30更高的游离巯基和氨基酸基团水平。蛋白质溶解度无显著变化；然而，PP30起泡能力增加16%，PAW30增加10%，两者泡沫稳定性均增加三倍。PP30还使乳化能力和稳定性提高三倍，并改善凝胶持水性。总体而言，与湿法等离子体预处理相比，干法预处理显著失活脂解酶，显著降低豆腥味不良风味，并增强功能特性。

冷等离子体预处理脱脂大豆粉调控大豆分离蛋白酶失活、风味及结构功能特性

研究背景与问题：大豆分离蛋白（SPI）在全球植物基蛋白市场中占比高，广泛用于烘焙、婴儿食品、饮料、植物基肉和乳类似物。但天然大豆粉中内源脂氧合酶（LOX）和脂肪酶（LP）可介导脂质氧化。LP催化三酰甘油水解，释放游离脂肪酸；LOX氧化多不饱和脂肪酸生成氢过氧化物，其分解为醛、酮、醇和呋喃等，导致豆腥、青草、纸板、哈败等不良风味。氧化产物还会修饰蛋白侧链，形成蛋白羰基，改变电荷分布、表面疏水性和分子柔性；巯基氧化可先暴露后形成二硫键和分子间交联，促进聚集，降低溶解性、乳化和起泡等功能。冷等离子体（CP）是非热技术，产生短寿命活性氧氮物种（RONS），如羟基自由基（^•OH）、原子氧、超氧、臭氧（O₃）、一氧化氮和二氧化氮，以及长寿命过氧化氢（H₂O₂）、亚硝酸盐和硝酸盐。干法针-板（PP）直接暴露短寿命RONS，湿法等离子体活化水（PAW）输送长寿命氧化剂。已有研究多关注大豆制浆等，而预处理脱脂大豆粉后提取SPI，比较干湿等离子体模式对酶失活、挥发物和蛋白品质的影响尚未广泛报道。研究假设CP预处理脱脂大豆粉可失活LP/LOX，并改变蛋白结构，从而改善功能。研究目的是考察干法和湿法CP预处理对脱脂大豆粉LP/LOX活性及所得SPI挥发、化学、结构及配料品质的影响。

关键技术方法：商业级脱脂大豆粉（脂质约2%）购自Solae LLC, MS, USA。采用干法PP和湿法PAW预处理；测定水溶液和豆粉中LOX/LP失活动力学；以碱性提取pH 9.0和等电沉淀pH 4.5制备SPI；采用SE-HPLC、ATR-FTIR、表面疏水性、内源荧光、游离/总巯基、游离氨基酸、溶解度、起泡、乳化、凝胶持水性及SPME GC-MS/MS靶向35种挥发物；用ANOVA/Tukey和动力学建模分析。

研究结果：
3.1 冷等离子体诱导的酶失活（Enzyme inactivation by cold plasma）
3.1.1 商业LOX和LP的失活（Deactivation of commercial LOX and LP）：水溶液中PP处理60 min，LP呈对数下降，55–60 min约降解70%；LOX下降更陡，60 min约降解85–88%。LOX比LP更敏感，反映酶结构、催化位点可及性、非血红素铁位点及关键残基氧化敏感性差异。
3.1.2 大豆粉中LOX和LP的失活（Deactivation of LOX and LP in soy flour）：豆粉中LOX和LP均显著降低，LOX更敏感，50–60 min残余活性达约70%降低；LP在40 min降低67%，之后无显著差异。因此后续实验采用30 min。
3.1.3 湿法和干法处理样品的降解动力学模型（Degradation kinetic modeling in wet and dry treated samples）：LOX水溶液符合二阶，豆粉符合零阶；LP水溶液符合零阶，豆粉符合二阶。表明均相水相中失活率较高，豆粉基质中较低，且机制不同。
3.1.4 蛋白分离物中残留酶活性（Residual enzyme activity in protein isolates）：对照蛋白纯度84.12%，PAW30为83.68%，无显著差异；PP30显著较低为80.08%。提取后LOX残留为PP30 54.70%、PAW30 81.10%；LP残留为PP30 57.89%、PAW30 65.67%。干法在SPI中残留酶活更低。
3.1.5 提取蛋白分离物的挥发物谱（Volatile profile of the extracted protein isolates）：对照中己醛、反-2-己烯醛和1-辛烯-3-醇等最高。PP30降低豆腥/青草醛类，如己醛、反-2-己烯醛、3-己烯-1-醇、1-己醇和1-辛烯-3-醇，酮类略有增加。PAW30增加醇酮类，如1-辛烯-3-醇、(E)-辛-2-烯醛、苯乙酮和2-戊基呋喃；己醛、反-2-己烯醛和反-2-壬烯醛高于对照和PP30，壬醛、十二烷和十二醛降低。分层聚类显示PP30远离豆腥青草，PAW30更趋果香和奶油香。干湿模式决定挥发物和不良风味。
3.2 结构和化学变化（Structural and chemical changes）
3.2.1 分子量分布（Molecular weight distribution）：对照>100 kDa为68.61%，60–80 kDa为9.43%，30–40 kDa为15.16%，5–20 kDa为3.36%，<5 kDa为3.34%。PP30 >100 kDa为84.05%，60–80 kDa为2.65%，5–20 kDa为1.10%，<5 kDa为12.20%；PAW30 >100 kDa为86.28%，5–20 kDa为2.49%，<5 kDa为8.85%。两处理促进低分子向高分子聚集。
3.2.2 二级结构（Secondary structures）：对照α-螺旋10.3%、β-折叠15.0%、β-转角8.5%、无规卷曲25.1%、酰胺II 41.1%。PP30 α-螺旋8.4%，β-折叠18.8%，β-转角12.4%，无规卷曲27.5%，酰胺II 32.9%。PAW30无显著变化。干法引起部分去折叠和重排，湿法较温和。
3.2.3 三级结构变化（Tertiary structural changes）：表面疏水性对照115，PP30约125显著升高；PAW30与对照无差异。内源荧光最大发射约320 nm，强度65,000–70,000 A.U.，样品重叠，色氨酸环境相似。变化主要在蛋白表面。
3.2.4 巯基和二硫键含量（Sulfhydryl and disulfide content）：对照游离SH为2.93 μmol/g，总SH为5.34；PP30游离SH为5.15，总SH为6.07；PAW30与对照无显著差异。干法暴露半胱氨酸、促进SH/SS交换和聚集。
3.2.5 游离氨基酸含量（Free amino acid content）：对照约0.46–0.47 mg/mL，PP30增至0.52，PAW30无显著差异且低于PP30。干法促进骨架断裂或侧链修饰，释放游离氨基。
3.3 功能特性（Functional properties）
3.3.1 溶解度（Solubility）：对照68.5%，PP30 66%，PAW30 65%，无显著差异。
3.3.2 起泡特性（Foaming properties）：对照起泡能力14.36%，PP30 31.96%，PAW30 17.75%；60 min泡沫稳定性对照16.03%，PP/PAW分别为42.57%和42.86%。改善与去折叠、疏水基暴露和柔性片段有关。
3.3.3 乳化特性（Emulsion properties）：PP30乳化活性显著高于对照和PAW30；对照和PAW30无显著差异。乳化稳定性所有处理提高，PP30前30 min显著高于PAW30，之后无显著差异但优于对照。干法改善初始乳化活性，两者改善稳定性。
3.3.4 凝胶特性（Gelation properties）：凝胶持水性对照55.75%，PP30 66.76%，PAW30 61.05%。二级结构变化、高分子量和游离SH增强网络。

讨论部分总结：研究人员认为，冷等离子体预处理脱脂大豆粉可同时调控内源酶和SPI品质。干法PP比湿法PAW更有效失活LP/LOX，降低豆腥和青草醛类，增加游离SH和游离氨基酸，二级结构向较低α-螺旋和较高β-折叠/无规卷曲转变，分子量向聚集体和低分子组分转变，pH 7溶解度不变；功能上改善起泡、乳化稳定和凝胶持水。PAW较温和，酶失活较低，挥发物更向果香、奶油和柑橘酮醇偏移。局限包括未直接定量RONS、蛋白羰基、特定氨基酸氧化产物和酶活性位点修饰；未来需解析氧化机制并评估贮藏和感官性能。

研究结论翻译：冷等离子体预处理脱脂大豆粉，无论采用干法粉预处理还是湿法PAW处理，均有效调节所得分离物中的酶活性和蛋白质品质。与湿法等离子体处理豆粉相比，干法等离子体处理显著降低豆粉中LP/LOX残留活性。该效应延续至提取蛋白，其中残留LOX和LP活性显著降低。PAW显示较低酶活性降低，表明其因处理模式而具较温和结构影响。冷等离子体预处理脱脂大豆粉改变所得蛋白分离物的挥发性谱，干法等离子体降低豆腥味和青草味醛类，PAW增加若干果香、奶油香和柑橘型酮类和醇类。此外，干法等离子体处理增加游离巯基和游离氨基酸含量，使二级结构略向较低α-螺旋和较高β-折叠/无规卷曲转变。分子量分布也向较大聚集体和较少低分子量物种转变，而pH 7.0溶解度保持不变。这些结构变化进一步转化为增强的起泡能力和稳定性、更高的乳化活性以及PP30处理改善的凝胶持水性。此外，30 min后溶解度和乳化稳定性等功能特性无显著变化。PAW蛋白的凝胶和起泡能力显著改善，与干法等离子体处理30 min相当。本研究的局限包括未直接定量RONS、蛋白羰基、特定氨基酸氧化产物和酶活性位点修饰。未来研究可直接表征氧化机制并评估贮藏和感官性能。总体而言，该研究表明冷等离子体预处理大豆粉可作为靶向工具，失活内源酶并增强大豆分离蛋白的结构和技术功能特性，使其成为多用途食品配料。