基于代谢组学的脑缺血再灌注损伤（CIRI）代谢物标志物发现：flavopiridol相关代谢物（FRM）的神经毒性机制与功能验证

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Discovery of metabolite biomarkers for cerebral ischemia-reperfusion injury based on metabolomics: neurotoxic mechanism and functional validation of a flavopiridol -related metabolite

　　

目的：探究代谢物改变在脑缺血再灌注损伤（CIRI）中的作用及潜在机制，并探索用于该疾病诊断的新型候选分子标志物。方法：采用改良Longa EZ线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。通过改良神经功能严重程度评分（mNSS）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色、苏木精-伊红（HE）染色和尼氏（Nissl）染色综合评价梗死状态。采用非靶向代谢组学检测CIRI后血清代谢物变化，并使用ProTox工具预测显著改变代谢物的潜在毒性作用。随后，采用生物信息学分析识别与目标代谢物相关的核心靶点和关键通路，并通过分子对接和分子动力学（MD）模拟预测其相互作用。结果：代谢组学分析鉴定出41个显著上调和232个下调代谢物。在显著改变的代谢物中，一种flavopiridol相关代谢物（FRM）表现出潜在神经毒性特征。共有193个CIRI相关核心靶点与该代谢物相关，进一步筛选出10个核心靶点和15条关键通路。受试者工作特征（ROC）分析提示该代谢物具有良好区分能力（曲线下面积AUC = 0.94）。分子对接结果显示所有核心靶点结合能小于?7 kcal/mol。100 ns分子动力学模拟表明，FRM与SRC形成的复合物保持结构稳定，表现为均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）和蛋白-配体均方根偏差（P-L-RMSD）值平衡。计算结合自由能为?32.48 kcal/mol，关键残基LEU-393、MET-341和GLU-339对相互作用贡献显著，提示潜在生物活性。结论：本研究揭示CIRI期间复杂代谢重编程现象，并初步鉴定FRM为潜在候选分子标志物和可能干预靶点，为未来CIRI诊断和治疗研究提供新理论基础和方向。

研究背景：根据全球疾病负担研究（GBD）2021，卒中仍是全球重大健康威胁，为全球第三位死亡原因和第四位伤残调整生命年（DALYs）原因；2021年约造成730万死亡和1.605亿DALYs。1990—2021年，新发卒中、卒中相关死亡和残疾负担显著增加，新发卒中增加70%，死亡增加44%。若无有效干预，未来25年全球卒中死亡可能增加50%；全球年经济损失估计为1.6万亿美元，并预计到2050年显著上升。缺血性卒中约占全球新发卒中的65.3%。及时恢复缺血区血流是改善患者结局的核心策略，但再灌注可触发氧化应激、钙超载和炎症反应等复杂病理级联，导致继发性脑损伤，即脑缺血再灌注损伤（CIRI，缺血后血流恢复引发的二次损伤）。再灌注后，谷氨酸等氨基酸化合物介导的兴奋毒性触发神经炎症、氧化应激、血脑屏障（BBB）通透性增加、脑血管舒张和神经元凋亡，破坏神经传递稳态并导致神经元损伤或死亡。自由基攻击细胞膜和蛋白上的多不饱和脂肪酸（PUFAs）引起的脂质过氧化（LPO，自由基攻击膜脂质）被认为是多种氧化应激相关疾病的核心机制，并与凋亡和坏死性细胞死亡密切相关。花生四烯酸来源代谢物如前列腺素E₂（PGE₂）在炎症和神经毒性中具有双重作用，是骨关节炎、过敏性哮喘、类风湿关节炎和卒中等疾病的关键炎症介质。这些毒性因素共同造成“第二次损伤浪潮”，导致延迟性神经元死亡并加重CIRI。因此，亟需开发新型神经保护策略。研究人员旨在探究CIRI后血清内源性代谢物动态变化，识别潜在特异性早期诊断分子标志物，为早期干预提供新见解。网络毒理学采用“毒性成分–基因–疾病”网络模型预测物质毒性；非靶向代谢组学可无偏检测小分子代谢物，血清采样微创，具有临床转化潜力。

研究人员开展了动物模型、非靶向代谢组学、网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟相结合的研究。研究人员建立大鼠MCAO模型，通过mNSS、TTC、HE和Nissl染色验证模型；检测CIRI后血清代谢物改变，预测其毒性，筛选核心靶点和关键通路，并对FRM与SRC相互作用进行模拟。研究鉴定出273个显著差异代谢物，其中41个上调、232个下调；FRM上调并被ProTox预测具有神经毒性，ROC分析AUC达0.94；FRM与CIRI相关基因交集193个，筛出10个核心靶点和15条关键通路；分子对接和分子动力学提示FRM与SRC可形成较稳定复合物。研究结论初步提出FRM是CIRI潜在候选分子标志物和可能干预靶点，为CIRI诊断、治疗及代谢机制研究提供新理论依据。

关键技术方法概述：研究使用16只SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，起始体重260 ± 30 g，由湖南Slake Jingda Co., Ltd.提供；排除不符合建模标准动物后，最终12只纳入，每组n = 6。采用改良Longa EZ线栓法建立MCAO模型；通过mNSS、Zea Longa评分、TTC染色、HE染色和Nissl染色评价模型。采用UPLC-MS/MS进行非靶向代谢组学检测，设置质量控制（QC）样本，按代谢组学标准倡议（MSI）置信等级分类，使用PCA和OPLS-DA分析，以VIP >1和FDR校正q值 <0.05筛选差异代谢物。采用ProTox-3.0预测毒性；整合ChEMBL、STRING、SwissTargetPrediction及疾病数据库，进行Venn交集、STRING蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络、Cytoscape拓扑分析、GO和KEGG富集及ROC分析；采用AutoDock Vina分子对接；采用GROMACS 2025进行100 ns分子动力学模拟，并以MM-PBSA计算结合自由能。

研究结果：
3.1 CIRI对大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织病理损伤的影响：通过Longa评分、mNSS、TTC、HE和Nissl染色发现，模型组术后第1天神经功能缺损评分显著高于假手术组；TTC显示模型组脑梗死体积显著增加；HE和Nissl显示模型组皮质神经元排列紊乱、分布稀疏、细胞数减少、结构破坏，并出现核固缩、碎裂和坏死改变，表明CIRI模型成功建立。
3.2 代谢组学分析：
3.2.1 数据质量控制：QC样本中目标化合物保留时间和峰强度稳定，PCA显示两组样本主要分布于95%置信区间内，OPLS-DA模型参数为R²Y = 0.903、Q² = 0.516，表明数据质量、仪器稳定性及组间代谢谱分离良好。
3.2.2 差异代谢物筛选：基于VIP >1和P < 0.05，共鉴定273个显著差异代谢物，其中41个上调、232个下调；HMDB分类显示主要为脂质和类脂分子、有机酸及衍生物、苯及取代苯、有机杂环化合物等。显著上调的包括α,α′-trehalose 6-phosphate、FRM和myo-inositol，显著下调的包括(diethylamino)(oxo)acetic acid、cholesteryl sulfate和2-[5-(2-hydroxypropyl)oxolan-2-yl]propanoic acid。
3.3 网络毒理学与非靶向代谢组学联合分析结果：
3.3.1 毒性分析：使用ProTox-3.0对5个上调代谢物进行毒性预测，FRM被预测为最高毒性等级（Class IV），并具有神经毒性概率0.73、肾毒性0.52、呼吸毒性0.97、免疫毒性0.85、血脑屏障破坏0.74和临床毒性0.67，提示其为药物诱导神经损伤的关键候选代谢物。
3.3.2 FRM诱导神经毒性及CIRI潜在靶点：ChEMBL、STITCH和SwissTargetPrediction数据库分别预测FRM相关靶点，合并去重后得到614个独特靶点；从5个疾病数据库检索到5057个CIRI相关基因；交集分析获得193个重叠基因。STRING PPI网络和Cytoscape拓扑分析以degree centrality ≥96定义核心靶点，得到10个核心靶点：AKT1、SRC、EGFR、MYC、JUN、PPARG、CCL2、ERBB2、JAK2和CXCR4，并构建“代谢物–靶点–疾病”网络。
3.3.3 富集分析与ROC分析：GO富集显示生物学过程主要涉及蛋白磷酸化、信号转导、炎症反应、趋化和表皮生长因子受体信号通路；分子功能主要富集于蛋白激酶活性、ATP结合和组蛋白H3Y41/H2AXY142激酶活性；细胞组分主要富集于胞质、质膜和细胞表面。KEGG显示主要富集于MAPK、PI3K-Akt、Ras、Rap1、ErbB、神经营养因子和趋化因子信号通路。ROC分析显示FRM区分模型组与假手术组的AUC为0.94（95% CI：0.816–1.000），提示较高诊断准确性。
4 计算生物学验证：
4.1 分子对接：FRM可通过氢键、π–π堆积和疏水填充等与核心靶点活性口袋结合，所有核心靶点结合能均显示较强结合，其中FRM与SRC结合能最低，为?9.3 kcal·mol^?1；结构上FRM的5′-羟基与GLU-339形成氢键，环戊烷部分插入MET-341形成的疏水腔，呈现高亲和力“锚定–填充”结合模式。
4.2 分子动力学模拟：选择结合能最优的FRM-SRC复合物进行100 ns分子动力学模拟。RMSD和RMSF在10 ns后达到平衡，Rg和SASA分析提示配体结合后蛋白结构紧凑性增加，P-L-RMSD低且稳定，氢键分析提示分子间氢键对复合物稳定可能关键；0–100 ns结合自由能平均为?32.48 kcal/mol，LEU-393、MET-341和GLU-339等关键残基对相互作用贡献显著。

讨论部分总结：研究人员认为，网络毒理学整合公共数据库和生物信息学工具，有助于系统预测毒性成分与生物系统间复杂相互作用。本研究中MCAO模型成功由mNSS、TTC、HE和Nissl验证；非靶向代谢组学显示CIRI后发生显著代谢重编程。T6P作为葡萄糖代谢关键调节节点，可调节糖酵解与戊糖磷酸途径（PPP）平衡，并通过NADPH、GSH/GSSG等增强抗氧化能力；其上调还与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）介导的代谢适应相关，HIF-1α可上调GLUT1/3并促进F_2,6BP生成，增强磷酸果糖激酶-1（PFK-1）介导的糖酵解通量。胆固醇硫酸酯（CS）在CIRI中可能通过炎症调节和BBB重塑发挥血管保护作用，包括激活PPARγ/RXRα-LXRα通路、促进ABCA1/ABCG1表达、抑制NF-κB p65及TNF-α、IL-1β、VCAM-1等，并可抑制SGMS、影响鞘脂代谢。FRM被ProTox预测具有神经毒性、免疫毒性和BBB损伤，与CIRI病理特征一致，可能通过破坏BBB完整性、直接神经毒性及免疫稳态紊乱加重CIRI。核心靶点如AKT1、SRC、EGFR、JUN、MYC等与PI3K-Akt、ErbB等通路构成复杂网络；FRM作为环依赖性激酶（CDK）抑制剂和转录抑制因子，可能抑制PI3K/Akt通路，干扰神经血管单元（NVU）修复，并可能影响SRC–VEGF信号、EGFR-JAK2/STAT3、JNK/c-Jun及c-MYC相关过程。分子对接和分子动力学模拟为FRM与核心靶点尤其是SRC的相互作用提供初步计算支持，但研究人员强调这些仍属理论预测，需后续体外结合实验、细胞功能研究和动物模型验证。研究人员还指出，检测到的FRM并非内源性来源，Flavopiridol为合成化合物，其信号可能来自环境背景、饲料成分或数据库误注，且Flavopiridol可在肝脏形成葡萄糖苷酸结合物进入体循环，因此该代谢物更可能是外源性相关化合物而非内源性代谢物，但其与疾病状态的显著统计关联提示其可能作为候选生物标志物或反映疾病相关代谢紊乱，值得进一步研究。局限性包括每组6只大鼠样本量较小、非靶向代谢组学统计功效和普适性受限、代谢物-靶点-通路关系主要基于生物信息学预测和计算模拟、缺乏体外和体内功能验证、大鼠与人类种属差异可能影响临床转化；未来计划开展体外神经血管单元细胞机制研究、动物模型靶向代谢组学定量、结合生化指标评估神经毒性与预测代谢通路关联，并使用参考标准验证关键差异代谢物。

研究结论（翻译）：本研究整合动物模型、非靶向代谢组学和生物信息学分析，系统探究CIRI的代谢改变和潜在分子机制。采用大脑中动脉闭塞法成功建立局灶性脑缺血损伤模型，并通过mNSS评分、TTC染色、HE染色和Nissl染色等多维验证其稳定性。非靶向代谢组学分析显示，CIRI后血清代谢物如α,α′-trehalose 6-phosphate上调，而(diethylamino)(oxo)acetic acid和cholesteryl sulfate下调，提示CIRI诱导代谢重编程，涉及能量代谢、脂质稳态、神经递质平衡及炎症氧化应激等多条关键通路；这些紊乱共同加剧继发性损伤进展。进一步ProTox毒性预测和分子网络分析表明，上调的FRM可能干扰EGFR/SRC-PI3K-Akt信号转导，抑制参与神经血管修复的关键通路，并激活JAK2-CCL2/CXCR4等炎症-凋亡轴，从而协同加剧神经元死亡、神经炎症和血脑屏障破坏。不同于其经典抗癌作用，本研究首次提供证据提示FRM上调可能在CIRI中发挥潜在神经毒性作用，揭示其非经典病理功能，为CIRI代谢机制和潜在治疗靶点探索提供新理论见解。