葛根芩连汤通过重塑肠道菌群–胆汁酸轴并抑制NLRP3介导的细胞焦亡缓解高脂饮食联合DSS诱导的溃疡性结肠炎

《Frontiers in Immunology》：Gegen Qinlian decoction alleviates ulcerative colitis by remodeling the gut microbiota-bile acid axis and inhibiting NLRP3-mediated pyroptosis

　　

背景：葛根芩连汤（Gegen Qinlian Decoction, GQD）用于治疗肠道疾病，但其在由高脂饮食（high-fat diet, HFD）联合葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）暴露诱导的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）中的作用机制仍不清楚。方法：采用HFD加DSS诱导UC小鼠模型。通过超高效液相色谱–串联质谱（ultra-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry, UPLC–MS/MS）鉴定GQD成分。通过苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色和免疫荧光评估结肠病理和屏障完整性。通过16S rRNA基因测序和靶向代谢组学分析肠道菌群和胆汁酸（bile acids, BAs）。采用转录组学、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、蛋白质印迹（Western blotting）、粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）和分子对接研究机制。用20或50 μM脱氧胆酸（deoxycholic acid, DCA）处理脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的Caco-2细胞；评估细胞活力、NLRP3炎症小体相关基因表达以及闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）/咬合蛋白（Occludin）免疫荧光。结果：GQD改善肠道菌群失调，降低厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes）比值，增加Akkermansia muciniphila，减少Clostridium perfringens。其重塑胆汁酸代谢，降低初级胆汁酸（CA、TCA和CDCA等），增加次级胆汁酸（DCA、6,7-DKLCA和3β-DCA等）。转录组学提示NOD样受体信号通路受抑制。GQD抑制NLRP3炎症小体激活并降低ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD-N和白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）。对接将DCA优先作为候选NLRP3相互作用代谢物。在Caco-2细胞中，DCA剂量依赖性降低LPS诱导的NLRP3、ASC、GSDMD、IL1B和IL18 mRNA表达，并部分恢复ZO-1和Occludin信号，且无明显细胞毒性。FMT支持肠道菌群参与GQD介导的抗炎作用。结论：GQD通过重塑肠道菌群并纠正胆汁酸失调，从而抑制NLRP3炎症小体激活，缓解由HFD和DSS联合暴露诱导的UC。该研究强调肠道菌群–胆汁酸轴在GQD治疗效果中的作用。

研究背景：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）的一种，以结肠和直肠黏膜慢性、复发性炎症为特征。21世纪以来，亚洲、非洲和拉丁美洲等新兴经济体的UC发病率持续上升，中国UC患病率也逐年增加，已成为重要公共卫生问题。目前临床管理主要依赖5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid, 5-ASA）制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂，但这些药物的单靶点机制难以实现肠道微环境的系统修复，在合并基础疾病患者中应用受限。全球饮食模式“西方化”背景下，高脂饮食（high-fat diet, HFD）不仅增加UC风险，也常触发疾病复发或加重临床症状。既往研究表明，HFD通过诱导肠道菌群失调和损害肠黏膜屏障完整性加剧肠道炎症。菌群失调会显著改变肠道胆汁酸（bile acids, BAs）代谢，具体表现为具有胆盐水解酶（bile salt hydrolase, BSH）活性的细菌丰度下降，阻碍初级胆汁酸向次级胆汁酸转化，导致初级胆汁酸异常累积。初级胆汁酸异常累积不仅可直接损害肠上皮屏障完整性，还可作为损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）激活固有免疫，特别是触发NLRP3炎症小体介导的炎症级联，从而加重肠道炎症。NLRP3炎症小体是固有免疫中的关键多蛋白信号复合物，激活后通过裂解Caspase-1促进白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和IL-18成熟与释放，这些促炎细胞因子持续高表达与结肠组织免疫失衡和黏膜损伤密切相关。葛根芩连汤（Gegen Qinlian Decoction, GQD）源自《伤寒论》，由葛根、黄芩、黄连和甘草组成，传统用于治疗以腹泻、里急后重和便血为特征的“协热下利”，这些症状与活动期UC临床特征相似。临床试验的系统综述定量合成结果进一步证实，GQD联合常规药物治疗UC在提高应答率、降低复发率和改善UCEIS评分方面优于单用常规药物。近期研究提示GQD具有抗炎、改善肠黏膜损伤和调节肠道微生态的作用，但其干预UC的具体机制尚未完全阐明。因此，研究人员开展本研究，以探讨GQD是否通过重塑肠道菌群结构和BA谱，抑制NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡，从而缓解肠道炎症和屏障损伤。

主要关键技术方法：研究人员采用HFD预处理联合DSS诱导UC小鼠模型。GQD成分通过UPLC–MS/MS鉴定；结肠病理和屏障完整性通过H&E和免疫荧光评估；肠道菌群通过16S rRNA基因测序分析，胆汁酸通过靶向LC-MS/MS代谢组学定量。机制研究采用RNA测序、ELISA、蛋白质印迹、粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）和分子对接。体外以LPS刺激Caco-2细胞并给予20或50 μM DCA，检测细胞活力、NLRP3炎症小体相关基因表达及ZO-1/Occludin免疫荧光。动物为8周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自SiPeiFu Biotechnology Co., Ltd.；Caco-2细胞购自Hangzhou Jcellm Biological Technology Co., Ltd.；GQD药材来自First Affiliated Hospital of Jinan University；FMT供体为Model和GQD-H组小鼠，受体为抗生素鸡尾酒（antibiotic cocktail, ABX）处理小鼠。

研究结果：
3.1 葛根芩连汤成分的定性分析：研究人员采用UPLC–MS/MS鉴定GQD化学成分，并与MetWare Database注释比对，共鉴定2582种独特代谢物，同时对11个质量控制标志或关键生物活性化合物进行色谱指纹和比较分析；该结果说明GQD含有多种可检测化学成分。
3.2 GQD改善溃疡性结肠炎小鼠疾病症状：在实验I中，HFD喂养2周后除NC组外均用3% DSS诱导UC，并给予GQD-L、GQD-H或5-ASA灌胃7天。结果显示GQD-L、GQD-H和5-ASA改善体重下降趋势，降低疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI），改善结肠充血、水肿和缩短，减轻H&E染色所示炎症细胞浸润、上皮结构不连续和杯状细胞减少，并上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin。该结果说明GQD在HFD预处理的DSS小鼠模型中具有明确治疗作用，机制可能与保护肠道屏障完整性相关。
3.3 GQD调节溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群：对NC、Model和GQD-H组粪便进行16S rRNA基因测序，PCoA显示组间菌群组成明显分离。SIMPER分析显示Akkermansia muciniphila、Bacteroides sartorii和Escherichia coli是Model与GQD组差异的主要驱动物种。GQD干预降低厚壁菌门并增加拟杆菌门，使Firmicutes/Bacteroidetes比值下降；属水平增加Akkermansia和Lactobacillus，减少机会致病菌Parasutterella；种水平富集Akkermansia muciniphila和Lactobacillus johnsonii。LEfSe分析显示Model组Clostridium perfringens增加、Lactobacillus murinus减少，而GQD干预后Akkermansia muciniphila富集最突出并伴随Clostridium perfringens显著减少。该结果说明GQD可改善菌群失衡并促进肠道稳态恢复。
3.4 GQD调节DSS诱导UC小鼠模型的胆汁酸代谢：靶向代谢组学显示GQD组与Model组BA代谢谱在PCA中分离，OPLS-DA VIP图和差异代谢物条形图显示多种BA相对水平显著不同。Model组肠道中多种初级胆汁酸异常累积，包括CA、CDCA、TCA、Tω-MCA、Tβ-MCA和TCA-3S；GQD治疗显著下调这些初级胆汁酸，同时提高6,7-DKLCA和3β-DCA等次级胆汁酸水平。Spearman相关分析显示Proteus mirabilis、Enterococcus faecalis、Escherichia coli和Clostridium perfringens与多数初级胆汁酸正相关、与次级胆汁酸负相关；Akkermansia muciniphila、Corynebacterium stationis、Desulfovibrio fairfieldensis、Alistipes inops、Acutalibacter muris和Corynebacterium urealyticum与次级胆汁酸正相关、与多数初级胆汁酸负相关。该结果说明GQD可调控BA代谢，且菌群与BA代谢物密切相关。
3.5 DSS诱导UC小鼠中GQD治疗机制的转录组分析：对GQD组和Model组结肠组织进行RNA测序，共鉴定486个差异表达基因，其中224个上调、262个下调，PCA显示两组转录组谱分离。GSEA显示前20条差异调控通路中NOD样受体信号通路显著下调，NOD样受体信号通路详细GSEA显示显著负富集，NLRP3炎症小体通路关键分子IL-18、GSDMD、NLRP3和IL-1β表达下调。该结果提示GQD治疗作用与抑制NOD样受体信号和NLRP3炎症小体相关。
3.6 GQD通过抑制NLRP3炎症小体激活减轻UC小鼠肠道炎症：蛋白质印迹显示GQD-H显著降低NLRP3蛋白表达，并抑制pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、ASC和GSDMD-N表达；同时上调ZO-1和Occludin。ELISA显示Model组结肠组织TNF-α和IL-18显著升高，GQD治疗后显著降低。该结果说明GQD通过抑制NLRP3激活减轻UC小鼠肠道炎症反应。
3.7 DCA在Caco-2细胞中介导炎症小体激活抑制的体外评价：分子对接以NLRP3结构为受体，候选配体限定为LEfSe分析鉴定的次级胆汁酸及其衍生物。采用氢键优先排序，DCA成为领先的NLRP3相互作用次级胆汁酸，Baker-Hubbard和BINANA-like算法均显示其形成5个氢键，最低Vina亲和力为-8.141 kcal/mol。浓度梯度细胞毒性实验选择20 μM为DCA-L、50 μM为DCA-H。LPS暴露后，DCA减轻LPS诱导的Caco-2细胞活力下降，50 μM保护更明显，且单独50 μM DCA不明显影响细胞活力。免疫荧光显示LPS降低ZO-1和Occludin信号，DCA处理后增加。RT-qPCR显示LPS刺激后IL18、IL1B、GSDMD和ASC mRNA显著升高，DCA剂量相关地降低NLRP3、ASC、GSDMD、IL18和IL1B mRNA表达。该结果说明DCA可减轻LPS诱导的炎症反应并帮助保留紧密连接相关蛋白。
3.8 肠道菌群介导GQD对NLRP3炎症小体激活的抑制作用：研究人员进行FMT实验，先用ABX耗竭肠道菌群，再将Model或GQD-H供体粪便移植入受体小鼠。RT-qPCR验证显示FMT-GQD组Akkermansia muciniphila和Lactobacillus johnsonii相对丰度显著高于FMT-Model组，Escherichia coli和Enterococcus faecalis显著降低，趋势与16S rRNA测序一致，提示供体菌群成功定植。FMT-GQD受体肠屏障功能改善、炎症减轻，蛋白质印迹显示NLRP3及其下游蛋白pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、ASC、GSDMD-FL和GSDMD-N表达显著降低，ZO-1和Occludin显著增加；ELISA显示TNF-α和IL-18显著降低。该结果确认肠道菌群是GQD发挥抗炎作用的关键介质。

讨论部分总结：GQD在《伤寒论》中用于“协热下利”，其症状与活动期UC相似。近期临床试验显示GQD可降低UC患者UCEIS并维持低复发率。研究人员的多组学证据表明，GQD在HFD预处理的DSS模型中通过重塑肠道菌群–BA轴并抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡缓解UC，将传统用于肠道炎症疾病的GQD与现代“微生物群–代谢物–免疫”调控网络联系起来。GQD主要活性成分如小檗碱和黄芩苷等可改善UC或发挥抗炎作用；这些化合物口服后肠道生物利用度低、系统吸收差，常需肠道微生物生物转化以增强吸收或活性，例如小檗碱可被菌群代谢为二氢小檗碱，黄芩苷和汉黄芩苷可经微生物β-葡萄糖醛酸酶水解为黄芩素和汉黄芩素，甘草酸和甘草苷需微生物脱糖基转化为甘草次酸和甘草素，这些代谢物可上调ZO-1和Occludin并抑制肠上皮NLRP3炎症小体。菌群失调是UC关键病理特征，肠道菌群通过BSH影响牛磺酸或甘氨酸与胆汁酸的结合状态，并通过7α-HSDH和7α-脱羟基生成次级胆汁酸。本研究中GQD干预增加Bacteroides和Lactobacillus，富集Akkermansia muciniphila和Lactobacillus murinus，抑制Clostridium perfringens。BA作为微生物代谢关键信号分子，连接微生态与宿主免疫稳态；临床UC患者常显示次级BA如DCA和LCA降低、初级BA如CA升高。高浓度初级BA如CA和CDCA可作为内源性促炎刺激，诱导氧化应激和免疫反应；次级BA介导抗炎作用并缓解结肠炎症状。本研究中Model组初级BA如CA、CDCA和TCA异常累积，次级BA如DCA、6,7-DKLCA和3β-DCA耗竭，GQD干预改善该代谢失调。分子对接将DCA优先为连接GQD相关BA重塑与肠上皮炎症调节的候选代谢物，两种算法均识别5个氢键，ALA227、GLN624和TYR632在两个分析中重复出现。20–50 μM DCA在不明显细胞毒性范围内降低LPS诱导的NLRP3、ASC、GSDMD、IL18和IL1B mRNA表达，提示DCA可能在转录水平减弱LPS诱导的NLRP3炎症小体通路启动。既往研究提示BA可通过TGR5–cAMP–PKA轴促进NLRP3磷酸化和泛素化，从而抑制炎症小体激活；低浓度DCA也可通过TGR5–cAMP–PKA–NF-κB/NLRP3通路在 epithelial cell 相关炎症模型中发挥抗炎作用。GQD显著下调NLRP3、ASC和Caspase-1，阻断GSDMD-N介导的焦亡过程，并降低结肠IL-18和TNF-α，表明GQD在早期截断焦亡程序。FMT实验表明GQD处理供体菌群可再现直接给予GQD的关键保护表型，说明肠道菌群是GQD抗炎和屏障保护作用的必要介质，而非旁观者。研究局限包括16S rRNA测序和靶向BA代谢组学样本量较小，BA与NLRP3因果关系仅用一种代表性次级BA DCA在单一肠上皮细胞系中评估，FMT实验在抗生素处理伪无菌小鼠而非无菌动物中进行，且某些GQD成分如小檗碱和黄芩苷的生物活性可能依赖肠道微生物代谢。因此，所提出的调控级联应视为当前实验条件下得到支持的合理机制，而非普遍建立的模型；但多组学、FMT和生化分析的一致性支持主要发现。

研究结论翻译：总之，该研究表明葛根芩连汤（Gegen Qinlian Decoction, GQD）通过重塑肠道菌群并纠正胆汁酸（bile acids, BAs）代谢失调，从而抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡并维持肠道屏障完整性，缓解由高脂饮食（high-fat diet, HFD）联合葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）暴露诱导的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）。研究人员的发现从机制上将GQD治疗肠道疾病的传统用途与微生物群–BA–NLRP3轴的现代认识联系起来。肠道菌群–BA轴成为UC的关键治疗靶点，该研究为GQD在UC患者，尤其是具有高脂饮食背景患者中的临床应用提供了有力的实验支持。