一种简单几何、孔板兼容的3D打印氧气梯度腔室用于GelMA水凝胶基细胞培养及tirapazamine空间毒性评价

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：An oxygen gradient chamber with simple geometry for generating oxygen gradients in hydrogel-based cell cultures within a well-plate-compatible format

氧气梯度强烈影响3D组织中的细胞行为，但其在标准细胞培养中的受控实现仍具技术挑战。在此，研究人员提出一种用于水凝胶基细胞培养的简单3D打印氧气梯度腔室。该系统使用螺钉安装的玻璃盖局部限制明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶与其周围培养基之间的氧气交换，从而在无需泵、气体通道、额外化学品引入或复杂微流控的情况下，产生由扩散和消耗驱动的径向氧气梯度。包埋于GelMA水凝胶中的缺氧报告间充质干细胞（MSCs）在玻璃覆盖区域下方24 h后显示明显的缺氧传感器信号。直接氧测量证实梯度形成，构建体中部氧气水平稳定在约2% O₂，在外周区域增加至5%–6% O₂。作为概念验证，缺氧激活前药替拉扎明（tirapazamine, TPZ）被应用于2D细胞培养、两种不同刚度的3D水凝胶圆片以及氧气梯度腔室内。结果显示在2D MSC培养中具有氧依赖性毒性，常氧下IC₅₀值为148.7 μM，2.5% O₂下为20.4 μM。在3D水凝胶圆片中，常氧下计算IC₅₀值>400 μM，2.5% O₂下为47.3 μM。在氧气梯度腔室中，TPZ诱导的细胞死亡在中央缺氧区域增强。因此，所提出的腔室为在3D水凝胶培养中研究缺氧的时空效应和氧依赖性药物效应提供了一种易获取且孔板兼容、几何结构简单的平台。

氧气可用性是细胞生理、组织稳态和疾病进展的关键调节因素。体内细胞很少暴露于大气氧水平，局部氧张力因组织血管化程度、细胞与周围血管的扩散距离以及细胞类型特异性耗氧率而变化。该空间氧异质性参与胚胎发育、干细胞调控、伤口愈合、炎症和实体瘤进展等生理和病理过程。因此，能重现确定氧梯度的体外系统有助于在更接近生理条件下研究氧依赖性细胞行为和药物反应。3D水凝胶培养适合模拟体内细胞微环境，因其提供细胞-基质相互作用、力学线索和扩散限制转运条件，而传统2D单层培养缺乏这些。水凝胶的水-rich聚合物网络可模拟细胞外基质部分特征，并允许调节材料刚度、组成和降解行为。然而，3D构建中O₂可用性由扩散传递与细胞消耗之间的平衡决定，受构建几何、接种细胞密度和水凝胶性质影响。将3D培养与受控氧梯度结合，对在生理氧或缺氧条件下模拟肿瘤缺氧及研究氧依赖性药物反应尤为重要。但可重复、易获取且易用的3D细胞培养氧梯度仍具技术挑战。已有策略包括气体驱动微流控、化学氧清除、细胞密度梯度以及卷曲或厚水凝胶构建等，但许多平台需要专门制造、气体或泵连接、复杂微流控结构、额外化学组分或材料特异性化学。该团队此前报道的3D水凝胶氧梯度系统需要主动空气灌注和缺氧培养箱，限制其在标准细胞培养实验室中的常规使用。因此，研究人员开发了一种简单、低成本、孔板兼容的3D打印氧气梯度腔室，用于水凝胶基3D细胞培养。该系统由3D打印底部框架作为水凝胶模具，以及螺钉安装顶部部件将玻璃片固定于水凝胶中央区域。玻璃局部限制水凝胶与周围培养基之间的氧交换，未覆盖外周区域仍暴露于培养基供氧；结合细胞耗氧，该几何结构产生双向氧梯度，无需泵、气体通道、氧清除剂或复杂微流控。研究人员用含MSCs的GelMA水凝胶表征腔室，通过氧敏感传感器箔直接测量氧浓度，并用在HIF-1稳定时表达荧光蛋白UnaG的缺氧报告MSCs评估梯度形成。作为功能概念验证，研究人员在2D培养、3D GelMA水凝胶圆片和氧梯度腔室中评价TPZ毒性。该研究提出一种低复杂度、孔板兼容平台，用于在3D水凝胶培养中生成和分析氧梯度。

关键技术方法：研究人员采用计算机辅助设计（CAD）和MultiJet 3D打印制造腔室，并粘附于常规6孔板；合成不同功能化度（DoF）GelMA，以TNBS assay和振荡流变表征。原代人脂肪来源间充质干细胞（hAD-MSC，简称MSC）来自腹部整形术后脂肪组织，为单供体，经Hannover Medical School伦理批准，参考号3475–2017，供者知情同意；通过慢病毒转导HRE-dUnaG构建缺氧报告MSC。细胞包封于水凝胶，组装腔室后采用氧传感器箔非侵入测量O₂，荧光显微镜和活/死染色分析，TPZ处理，CTB和ImageJ定量，计算IC₅₀并进行统计。

3.1 腔室设计与制造：研究人员开发了简单氧梯度腔室，包括作为水凝胶模具的底部和可机械固定玻璃盖的顶部，顶部有适配6 mm宽玻璃片的凹槽和螺钉间隙孔，用M2螺钉固定。腔室设计兼容常规细胞培养耗材，并粘附于6孔板底部。底部标称容量200 μL，但填充225 μL以确保水凝胶表面与玻璃接触。玻璃覆盖水凝胶中央区域，阻断其与培养基氧交换，外周未覆盖区域仍可交换；预期在扩散距离最大处氧浓度最低，向未覆盖区域双向增加。腔室可选集成氧传感器箔以进行时空氧定量。结论：设计出孔板兼容、可常规显微镜观察的氧梯度腔室。

3.2 所形成氧梯度的表征：研究人员将未修饰MSCs嵌入高DoF GelMA，用基于磷光的氧传感器箔测量玻璃安装后超过1周的时空氧浓度；同时将缺氧报告MSCs嵌入GelMA，分析反映HIF-1α稳定的UnaG荧光随时间变化。

3.2.1 梯度腔室各段氧浓度的可视化与定量：氧传感器箔集成于腔室底部，监测8天；无覆盖对照与6 mm玻璃覆盖样本比较。VisiSens软件将水凝胶水平分为10段，3–8段位于玻璃下，1–2和9–10段未覆盖。未覆盖对照早期中央略降至约5% O₂，外段6%–6.5% O₂，随后中央降低消失。覆盖玻璃后3 h中央氧降低，24 h形成明显梯度，中央最低低于1% O₂，外周约3.5%–4% O₂；即使仅3–8段直接覆盖，未覆盖外周多数时间氧浓度也低于对照，提示双向梯度。初始稳定期后，从第5天起梯度相对稳定，中央约2% O₂，外段5%–6% O₂。结论：玻璃覆盖产生可维持数天的径向双向氧梯度。

3.2.2 用缺氧报告细胞可视化氧梯度：缺氧报告MSCs嵌入腔室，玻璃安装后10天内用荧光和明场显微镜分析。24 h后玻璃覆盖中央区域出现明显UnaG缺氧信号，表明形成缺氧区；Z轴不同层间无差异。信号随培养扩展，第4–5天稳定。低DoF水凝胶中信号持续前5天；高DoF水凝胶相同条件下信号仅前18 h出现。结论：细胞对梯度产生缺氧报告反应，且低/高DoF GelMA中反应不同。

3.3 缺氧激活前药替拉扎明（TPZ）的应用：为研究生成梯度能否测试空间依赖性药物反应，研究人员以TPZ为缺氧激活模型前药，先在确定常氧（21% O₂）和缺氧（2.5% O₂）下评价2D培养和3D GelMA圆片，再用于氧梯度腔室。

3.3.1 2D细胞培养中TPZ毒性：MSCs在2D培养中与6.25–400 μM TPZ孵育24 h，常氧或2.5% O₂。活/死染色显示氧依赖性细胞毒性增加，缺氧下活细胞剂量依赖性减少，最高TPZ浓度仅见少量圆形活细胞；常氧仅汇合度下降。PI染色确认缺氧样本死细胞更多。CTB定量显示常氧≤50 μM无显著活力降低；2.5% O₂所有测试浓度均显著低于对应常氧，最低6.25 μM时相对活力约65%。IC₅₀为21% O₂下148.7 μM、2.5% O₂下20.4 μM，毒性增加7.2倍。结论：TPZ在2D缺氧下细胞毒性更强。

3.3.2 3D水凝胶圆片中TPZ毒性：在7.5%低DoF和5%高DoF GelMA圆片中，低DoF G′为110 Pa，高DoF G′为1,570 Pa；TNBS测定DoF分别为29.3%和99.55%。包封细胞圆片用6.25–400 μM TPZ处理24 h，常氧或2.5% O₂。两种GelMA均显示氧依赖性TPZ毒性：常氧下即使400 μM仍有活细胞，Calcein-AM信号在圆片外缘最强；缺氧下同浓度活力很低。定量显示400–100 μM TPZ在2.5% O₂下细胞毒性比常氧高4.6倍，50 μM也显著增加。缺氧IC₅₀为47.3 μM，常氧无显著趋势。结论：3D水凝胶中达到同等毒性需要更高TPZ浓度，缺氧仍增强毒性。

3.3.3 梯度腔室中TPZ毒性：腔室有无6 mm玻璃覆盖形成梯度后，加200 μM TPZ处理24 h，以PI染色评估。TPZ处理样本均比无TPZ对照死细胞增多；无TPZ对照死细胞少，玻璃覆盖区未增加，表明覆盖过程未引起明显死亡。虽然未覆盖TPZ样本也有一定毒性，但玻璃覆盖区死细胞显著增加，表明TPZ诱导毒性在氧浓度最低的中央缺氧区增强。结论：物理氧梯度转化为空间依赖性药物毒性。

3.4 氧梯度腔室的进一步应用：研究人员设计可安装8 mm宽玻璃片的替代顶部件。24 h后，5%高DoF GelMA中的缺氧报告MSCs在覆盖区下方显示明显且加宽的UnaG缺氧信号，PI显示仅少量死细胞。还设计铸造梳，可在水凝胶灌注时形成三个不同组成片段，以创建垂直于双向氧梯度的梯度；预期双梯度形状，潜在应用包括刚度梯度、接种密度梯度、额外细胞类型共培养梯度或生物活性分子梯度。结论：腔室几何可调，并可用于未来正交梯度。

讨论部分总结：讨论指出，多数现有系统仅适用2D，需复杂处理，许多不能用标准倒置显微镜监测，限制常规实验室使用。本研究开发简单低成本3D水凝胶氧梯度腔室，可通过3D打印制造并在常规培养耗材中使用，依靠玻璃片部分覆盖细胞负载水凝胶局部限制O₂交换，外周仍可交换，细胞耗氧降低覆盖中央氧水平，无需气体灌注、外部泵或复杂微流控。直接氧测量证实明显空间梯度；非覆盖对照仅早期出现轻微瞬态梯度。覆盖后中央氧降低；水凝胶边缘氧变异性可能与几何变化、培养基侧向进入、打印材料自发荧光或粘合剂有关，但未直接评估。初始稳定期中央短暂低于1% O₂、外周约4% O₂，随后中央稳定约2% O₂、外周5%–6% O₂，这些水平可诱导HIF依赖反应并支持存活。氧传感器箔不透明，不能与显微镜信号同时使用；未来可用氧传感器珠。缺氧报告MSCs在24 h出现中央信号，第4–5天稳定。氧分布还受增殖、耗氧调整、基质重塑及水凝胶收缩/肿胀影响，外周收缩可能改变扩散面积，需尽量减小。高DoF GelMA仅早期出现报告信号，可能与刚度、孔径、细胞介导收缩和细胞活动有关；Schmitz et al. 表明高刚度GelMA中缺氧信号降低并非主要因氧渗透性低，而是细胞适应高储能模量，但本研究未系统研究机制。报告信号与直接氧测量初始最低值的时间差可能因荧光蛋白积累延迟。单供体是限制，不同细胞类型耗氧不同，每个细胞类型需表征梯度。Z轴氧梯度未定量解析，传感器仅测底部界面，报告细胞Z-stack提供定性信息；未来需微传感器或计算建模。TPZ是生物还原化合物，低氧下自由基中间体不能重氧化，引起DNA损伤，临床转化有限但适合作为体外氧依赖性毒性模型。2D MSC中IC₅₀由常氧148.7 μM降至缺氧20.4 μM；文献中TPZ缺氧毒性增加2–100倍。3D圆片中缺氧TPZ毒性增强，外围活细胞较多，可能因中央氧耗竭；与Schmitz et al. 在厚水凝胶圆片中的发现相似。TPZ在支架3D培养中研究少；本研究2D常氧148.7 μM vs 3D >400 μM，缺氧2D 20.4 μM vs 3D 47.3 μM，说明3D需要更高浓度，培养模型选择重要。腔室中TPZ导致覆盖中央缺氧区死细胞增加，非覆盖区也有残余毒性，可能与中度缺氧4%–6% O₂有关；不能完全排除玻璃覆盖造成局部药物浓度差异，但空间模式支持氧依赖性激活，未来应测局部TPZ浓度。GelMA因透明、生物相容和力学可调被选用，但腔室不限于GelMA；水凝胶溶胀不能过大，以免玻璃安装压力过大。水凝胶刚度和玻璃压缩可能影响细胞反应，需针对实验优化。未来正交梯度可用于迁移、共培养、生物活性或药理分子浓度梯度。氧梯度由扩散、腔室几何、玻璃覆盖和细胞代谢决定；长期培养、细胞密度、代谢需求、水凝胶批次差异和换液可影响梯度稳定性，需系统量化。高DoF GelMA中18 h报告活性机制需进一步研究。

研究结论翻译：综合而言，本研究展示了一种简单且易获取的3D水凝胶基氧气梯度腔室。该系统通过扩散屏障与细胞代谢引起的氧耗竭共同作用产生空间氧气梯度。它不需要任何泵、气体通道或透气膜、氧清除剂引入、复杂微流控或高分辨率3D打印。通过MSCs的缺氧报告信号并利用氧传感器箔直接定量，证明了氧气梯度形成。作为功能性概念验证，缺氧激活前药TPZ在腔室缺氧区域诱导增强的细胞死亡，同时在2D细胞培养和3D水凝胶圆片中也显示缺氧依赖性细胞毒性增加。该氧气梯度腔室为在3D环境中研究缺氧响应和氧依赖性药物效应提供了一个多功能平台。其简单几何结构和与标准细胞培养耗材的兼容性可能促进氧气梯度实验在生物材料研究、组织工程和疾病建模中的更广泛实施。