DGCR8动态磷酸化调控胚胎干细胞分化与Microprocessor功能的研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Dynamic phosphorylation of DGCR8 regulates embryonic stem cell differentiation and microprocessor function

Microprocessor复合体（由DROSHA和DGCR8组成）是microRNA（miRNA）生物合成的必需元件，也通过mRNA可变剪接和mRNA切割调节多能性与分化之间的平衡。然而，这些不同活性如何被调控仍不完全清楚。DROSHA和DGCR8均为磷蛋白，已有报道表明磷酸化影响其分子功能。本研究通过质谱分析鉴定了小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, mESCs）在分化为神经细胞前后差异磷酸化的DGCR8残基，其中包括在未分化细胞中磷酸化水平更高的S95，以及在分化细胞中磷酸化水平更高的S238。研究人员利用CRISPR/Cas9对内源Dgcr8基因进行基因组编辑，获得了纯合S95A mESC克隆和杂合S238A/- mESC克隆。两种突变体均保留了mESC表型，但表现出Microprocessor依赖性功能的改变和分化结果的差异。当定向诱导神经元谱系分化时，S238A/-突变体在10天后仍显示神经元祖细胞标志物mRNA表达升高，而S95A和S238A/-突变体在拟胚体分化培养中均未能产生心肌细胞。此外，使用高选择性抑制剂抑制MEK1/2可部分模拟S95A在mESCs中的转录效应，这与ERK/MAPK信号可能参与S95磷酸化的观点一致。综上所述，这些发现支持位点特异性DGCR8磷酸化在调节Microprocessor依赖性过程和mESC分化中的作用，确立了DGCR8磷酸化作为调控Microprocessor活性的重要机制，尤其在干细胞分化过程中具有重要意义。

研究背景与科学问题

Microprocessor复合体由核糖核酸酶III蛋白DROSHA和双链RNA结合蛋白DGCR8二聚体组成，是microRNA（miRNA）生物合成的核心机器。它负责识别并加工初级miRNA转录本中的茎环结构，产生的pre-miRNA随后被转运至细胞质并由DICER进一步处理，最终形成成熟miRNA并加载到RNA诱导沉默复合体中介导翻译抑制或mRNA降解。除miRNA加工外，Microprocessor还识别其他含有茎环结构的RNA物种，如病毒RNA和编码mRNA中的茎环，从而参与抗病毒防御、mRNA稳定性调控和可变剪接等生物学过程。在干细胞领域，Microprocessor通过miRNA生物合成、Tcf7l1可变剪接和mRNA切割等方式调节干细胞多能性和分化。

尽管已知DROSHA和DGCR8均为磷蛋白，且磷酸化修饰被认为能够调控其分子功能，但目前大多数磷酸化位点的鉴定基于过表达标记蛋白在HEK293T等细胞系中的分析，因此这些位点在生理条件下的功能和相关性仍不清楚。特别是，DGCR8的动态磷酸化是否参与干细胞分化过程中Microprocessor活性的调控，此前尚未被探究。本研究旨在解决这一科学问题。

研究内容与结论

研究人员从mESCs及其衍生的神经细胞中免疫沉淀内源性DROSHA和DGCR8，通过质谱分析绘制了内源蛋白上的磷酸化位点图谱。通过估算肽段磷酸化频率，研究人员鉴定出在神经分化过程中差异磷酸化的DGCR8残基。利用CRISPR/Cas9系统对两个候选位点进行突变，并研究了DGCR8磷酸化对Microprocessor功能和干细胞命运决定的影响。结果表明，破坏DGCR8磷酸化会影响分化结果，并影响Microprocessor依赖的miRNA生成、mRNA切割和可变剪接。这些发现揭示了DGCR8磷酸化作为调控Microprocessor活性的重要机制，尤其是在干细胞分化过程中的作用。

关键技术方法

1. 1.
   免疫沉淀：使用抗DGCR8和抗DROSHA抗体从mESCs和RA分化的神经细胞中富集内源蛋白。
2. 2.
   液相色谱-串联质谱：通过LTQ Orbitrap Elite或Orbitrap Fusion Lumos质谱仪鉴定磷酸化位点，数据经Proteome Discoverer处理和Sequest HT算法搜索。
3. 3.
   CRISPR/Cas9基因组编辑：设计guide RNA和单链寡脱氧核苷酸模板，通过核转染引入S95A和S238A点突变，并经PCR和Sanger测序验证。
4. 4.
   AlphaFold3结构预测：对包含DGCR8、DROSHA、heme、锌离子、钙离子和pri-miR-16-2的Microprocessor复合体进行建模。
5. 5.
   小RNA测序：使用Nextflex Small RNA v4文库制备试剂盒建库，在NovaSeq X平台测序，分析miRNA表达谱变化。

研究结果

内源Microprocessor组分的纯化

研究人员优化了从E14 mESCs中免疫沉淀内源DROSHA和DGCR8的方法。RIPA缓冲液可有效提取两种蛋白，但只有DGCR8能被高效免疫沉淀。对于DROSHA，需延长一抗孵育时间以提高产率。

DGCR8在神经分化过程中发生差异磷酸化

通过质谱分析，研究人员获得了mESCs和RA处理mESCs中DGCR8分别81.76%和76.07%的序列覆盖率。比较磷酸化频率估计值后发现，两个DGCR8肽段在mESCs中磷酸化增强，四个肽段在神经分化细胞中磷酸化增强。定位分析确认了S8、S95、S109、S238、S271、S275、S373、S377、S434、S619和S714等位点。大多数差异磷酸化位点位于内在无序区域。

DROSHA磷酸化分析

研究人员检测到DROSHA五个磷酸化区域，包括T272、S354、S356、S372和S806，但由于DROSHA免疫沉淀产率低，无法进行定量比较。

AlphaFold3分析

磷酸化位点大多位于低置信度区域，含单个磷酸化残基的模型与未修饰模型在构象上存在差异，但这些预测需实验验证。

生成DGCR8特异性磷酸缺陷mESCs

通过CRISPR/Cas9成功获得纯合S95A和杂合S238A/- DGCR8 mESC克隆。两种突变体均表达DGCR8蛋白，但丰度低于野生型。S238A/-约50%的丰度符合单等位基因贡献。两种突变体形成的mESC集落形态与野生型无异，且多能性标志物Nanog和Oct4的mRNA表达无显著差异。

S95和S238磷酸缺陷mESCs表现出改变的分化潜能

在神经分化条件下，S238A/-突变体显示Nanog下调不充分，同时神经祖细胞标志物Sox1和Nestin显著高于野生型。两种突变体的神经元网络形成均较少。在自发分化中，S95A和S238A/-的Tnnt2表达显著降低，且均未观察到跳动的心肌细胞。突变体EB中出现更早的空洞化现象。

在DGCR8缺陷细胞中重新表达S95A和S238A突变体

将DGCR8磷酸缺陷突变体重新导入DGCR8敲除mESCs后，S95A和S238A表达细胞在RA或EB分化后均显示出比野生型DGCR8表达细胞更高的Nanog mRNA表达。

S95A和S238A/- mESCs的成熟miRNA表达谱轻度改变

小RNA测序显示，S95A突变体中6个miRNA上调、13个下调；S238A/-中25个上调、8个下调。差异表达的miRNA在两个突变体间重叠很少，提示S95A的改变不太可能仅由DGCR8表达减少解释。

S95A mESCs的Chpf2 mRNA切割增强

S95A突变体中，Chpf2 mRNA的切割产物与未切割产物比值显著增加，表明S95磷酸化影响Microprocessor介导的mRNA切割活性。

S95A mESCs的Tcf7l1 mRNA异构体组成改变

S95A突变体中Tcf7l1长异构体表达上调，导致异构体组成比例改变，这与DGCR8磷酸化调控可变剪接的观点一致。

S95A和S238A/- mESCs中待命基因转录不受影响

两种突变体中Chic1和Rev3l的表达均无变化，表明S95和S238磷酸化对于FLII的隔离功能并非必需。

ERK/MAPK信号可能调控DGCR8 S95磷酸化

MEK1/2抑制剂PD0325901处理部分模拟了S95A突变体的转录效应，如Nanog轻度上升、Gata6和Hand1下调，但抑制剂的效应更强且在DGCR8敲除细胞中仍然存在，提示ERK/MAPK信号可能通过多条途径发挥作用。

讨论与结论

本研究首次在mESCs分化前后对内源DROSHA和DGCR8进行磷酸化位点图谱绘制，证明这些修饰确实发生在内源蛋白水平而非过表达条件下，并且磷酸化状态随细胞分化状态动态变化。S238磷酸化在mESCs中不可检测，仅在分化后出现，其破坏导致神经分化中Sox1和Nestin持续高表达，但杂合敲除基因型使结果解读复杂化。S95突变则改变了神经和自发分化结果，表现为Nanog轻度升高、Gata6和Hand1显著降低，以及心肌细胞缺失。小RNA测序揭示S95A中miRNA表达谱改变，其中miR-302簇的下调提示加工效率改变。S95A还增强了Chpf2 mRNA切割并改变了Tcf7l1异构体组成，促进长异构体表达。ERK/MAPK通路可能参与S95磷酸化调控，但需进一步验证。

研究结论

本研究表明，DGCR8磷酸化是调控Microprocessor活性和干细胞分化结果的重要机制。