《Frontiers in Neurology》：Cross-dataset transcriptomics–proteomics analysis identifies Tlr2, Anxa5, and Grin2a as candidate mouse-brain signatures associated with chronic cerebral hypoperfusion
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背景：慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion, CCH）是一种以持续性脑血流量不足为特征的神经系统疾病，但目前缺乏特异性生物标志物和机制性见解。
方法：本研究整合了转录组学和蛋白质组学多组学分析，并结合双侧颈总动脉狭窄（bi
背景：慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion, CCH）是一种以持续性脑血流量不足为特征的神经系统疾病，但目前缺乏特异性生物标志物和机制性见解。
方法：本研究整合了转录组学和蛋白质组学多组学分析，并结合双侧颈总动脉狭窄（bilateral common carotid artery stenosis, BCAS）小鼠模型的行为学评估和免疫荧光验证，旨在识别和验证CCH的候选多组学生物标志物，并探索其潜在的可成药性。通过利用公共转录组数据集和内部蛋白质组数据，研究人员进行了差异表达分析、蛋白质-蛋白质相互作用网络构建以及五种拓扑算法，确定了Tlr2、Anxa5和Grin2a作为候选生物标志物。
结果：BCAS小鼠在行为学测试中表现出空间记忆障碍。免疫荧光显示TLR2和ANXA5上调，GRIN2A下调，并且TLR2-IBA1共定位增加，表明小胶质细胞活化。Tlr2和Anxa5与浸润性免疫细胞呈正相关，而Grin2a呈负相关。一个假定的ceRNA网络和计算机分子对接表明，匹立尼酸（pirinixic acid）与TLR2和ANXA5均具有强结合力。
讨论：Tlr2、Anxa5和Grin2a可作为小鼠脑中CCH的候选多组学特征分子，其在转录组、蛋白质组和组织水平上表现出一致的改变。
研究背景与目的
慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion, CCH）是一种由颅内动脉狭窄或闭塞以及脑小血管疾病导致的持续性脑血流量不足状态，其核心在于长期低灌注引发的多系统、进行性病理变化。流行病学研究显示，约30%的45至50岁人群有CCH病史，而在80岁以上人群中这一比例高达70%。CCH可诱发或促进一系列神经系统疾病和功能障碍，包括血管性认知障碍（vascular cognitive impairment, VCI）、血管性痴呆（vascular dementia, VaD）、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）、白质高信号（white matter hyperintensities, WMH）、白质微结构破坏和脱髓鞘。其致病机制复杂，涉及血脑屏障破坏、神经炎症、氧化应激和线粒体功能障碍等多条相互交织的通路。然而，临床诊断主要依赖神经影像学和神经心理学测试，缺乏高特异性和敏感性的分子生物标志物，严重阻碍了早期干预和有效治疗。单组学分析受限于单一维度的信息框架、较高的假阳性率以及不完整的机制解读。因此，本研究旨在通过整合公开转录组数据和来自双侧颈总动脉狭窄（BCAS）小鼠模型的内部数据非依赖性采集（data-independent acquisition, DIA）蛋白质组数据，系统性地识别CCH的候选生物标志物，并通过多维分析阐明其生物学功能和药物靶向潜力。
研究方法概述
研究人员建立了BCAS小鼠模型（C57BL/6J雄性小鼠，随机分为假手术组n=6和模型组n=6），术后28天进行旷场实验（open field test, OFT）和Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）行为学测试。收集脑组织进行免疫荧光染色验证。蛋白质提取后经胰酶消化，采用纳升级液相色谱-串联质谱（DIA模式）进行蛋白质组数据采集。同时从GEO数据库获取两个公开转录组数据集（GSE210666和GSE275195）。通过差异表达分析、韦恩图取交集、STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并使用cytoHubba插件的五种拓扑算法（Stress、Degree、MNC、Betweenness、EPC）筛选核心基因。利用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线评估诊断性能。进一步进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）、免疫浸润分析（mmcp-counter算法）、ceRNA调控网络构建（TarBase、miRNet平台）以及基于CTD数据库的药物预测和AutoDock Vina分子对接。
研究结果
3.1 BCAS模型小鼠在行为学测试中表现出焦虑样行为和空间记忆缺陷：旷场实验中，BCAS小鼠的总移动距离和平均速度显著低于假手术组，表明自发探索活动减少；Morris水迷宫获得期，BCAS组逃避潜伏期更长，空间学习速度较慢；探查试验中，BCAS小鼠穿越平台次数显著减少，首次到达目标区域潜伏期延长，证实存在空间记忆损伤，且排除了运动功能障碍的干扰。
3.2 CCH相关共同差异表达基因的鉴定与功能富集分析：在两个转录组数据集中分别鉴定出4416个和3478个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），取交集得到1483个共同上调基因和393个共同下调基因。功能富集分析显示这些基因显著富集于免疫和炎症相关通路，如细胞因子介导的信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等。
3.3 CCH中的蛋白质组学分析与功能富集：蛋白质组学鉴定出1433个差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs），其中824个上调、609个下调。功能富集分析显示这些蛋白显著富集于神经元功能和信号转导相关通路，如神经元突触可塑性调节、神经递质转运、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路以及神经变性通路等。
3.4 鉴定Tlr2、Anxa5和Grin2a为候选生物标志物：将转录组与蛋白质组的差异表达基因/蛋白取交集，得到85个共同上调、63个共同下调的基因/蛋白。通过PPI网络和五种拓扑算法的交集，最终确定Tlr2、Anxa5和Grin2a为核心候选生物标志物。验证发现，Tlr2和Anxa5在所有三个数据集中均显著上调，Grin2a显著下调，趋势一致。ROC曲线分析显示三个基因在所有数据集中的AUC值均大于0.7，具有良好的区分能力。
3.5 免疫荧光结果：免疫荧光染色显示，BCAS组大脑皮层中TLR2阳性面积和IBA1阳性面积平均值高于假手术组，且TLR2与IBA1共定位增加，提示TLR2主要在激活的小胶质细胞中表达。ANXA5阳性面积在BCAS组中平均值升高，而GRIN2A阳性面积平均值降低，验证了多组学分析结果。
3.6 Tlr2、Anxa5和Grin2a的GSEA富集与细胞定位：GSEA显示三个基因共同富集于免疫和炎症相关KEGG通路，如Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路等。亚细胞定位预测TLR2和GRIN2A主要位于质膜，ANXA5主要分布于细胞质。
3.7 生物标志物与免疫细胞的关联：免疫浸润分析显示，CCH组中嗜碱性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、自然杀伤（NK）细胞、总T细胞和CD8+T细胞的浸润水平显著改变。相关性分析表明，Tlr2和Anxa5的表达与上述免疫细胞浸润呈显著正相关，而Grin2a呈显著负相关。
3.8 候选生物标志物的调控网络分析与相关通路：构建了包含3个生物标志物和18个转录因子的mRNA-TF调控网络，以及包含3个mRNA、9个miRNA和10个lncRNA的ceRNA调控网络。GeneMANIA分析显示三个核心基因与20个高度相关基因存在广泛互作，功能富集于免疫炎症和神经功能相关通路。
3.9 潜在治疗化合物的鉴定与分子对接验证：通过CTD数据库预测并筛选出三种共有化合物（匹立尼酸、颗粒物、双酚A）。分子对接显示，匹立尼酸与TLR2（结合能-7.3 kcal/mol）和ANXA5（-7.5 kcal/mol）均表现出良好的结合亲和力，双酚A与GRIN2A的结合亲和力最强（-7.7 kcal/mol）。
讨论与结论
讨论部分指出，Tlr2和Anxa5上调、Grin2a下调在转录组和蛋白质组水平趋势一致，ROC分析显示三者均具有良好的区分能力。TLR2作为先天免疫系统的关键模式识别受体，可通过识别损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）激活TLR2-MyD88-NF-κB信号轴，加剧神经炎症反应。ANXA5作为一种钙依赖性磷脂结合蛋白，在脑缺血中的作用具有多面性。GRIN2A作为NMDA型谷氨酸受体的关键功能亚基，其下调可能构成CCH诱导认知功能障碍的重要分子基础。免疫浸润分析揭示了外周适应性免疫细胞向脑内浸润的增加，并与三个生物标志物显著相关。ceRNA调控网络和TF-mRNA网络的构建揭示了多层级的分子调控机制。分子对接结果为匹立尼酸和双酚A的潜在作用提供了初步证据。
研究结论：通过整合转录组和蛋白质组多组学数据、构建PPI网络以及五种cytoHubba算法的交叉验证，本研究系统性地鉴定了CCH的三个候选生物标志物——Tlr2、Anxa5和Grin2a，它们在发现数据集中均显示出良好的区分性能（AUC > 0.70）。BCAS小鼠模型的行为学评估证实了显著的运动能力和空间认知缺陷。免疫荧光染色在组织水平提供了支持性证据。GSEA、免疫浸润分析和ceRNA网络构建进一步提示了候选生物标志物的生物学功能背景，而计算机分子对接分析预测所有三个靶点均具有可成药的结合能力。总之，这些发现表明Tlr2、Anxa5和Grin2a是小鼠脑中CCH的候选多组学特征分子，其在转录组、蛋白质组和组织水平上表现出一致的改变。这些产生假说的发现为未来的机制研究和诊断治疗策略的开发提供了参考框架，但仍需独立验证。然而，这些关联并非因果关系，需要进行功能性和人体验证；TLR2、ANXA5和GRIN2A分别对应于神经炎症、屏障保护和兴奋性毒性，支持未来在CCH中进行针对性验证和潜在的疾病修饰策略。
