白术（Atractylodes macrocephala）不同品质等级表观遗传变异与“土壤环境-根际微生物”协同调控次生代谢机制研究

《Frontiers in Plant Science》：Research on the epigenetic alterations in Atractylodes macrocephala and the synergistic regulatory mechanism of “soil environment-rhizosphere microbes” on its secondary metabolism

　　

引言：白术（Atractylodes macrocephala）作为一种传统中药，在中国具有悠久的栽培历史和强劲的市场需求。然而，已有研究主要集中于其种质资源和药用特性，而关于次生代谢（secondary metabolism）与根际土壤环境因子之间相互作用机制的研究仍不充分。方法：本研究考察了4个品质等级的白术，基于表观遗传变异（epigenetic variation）评估，系统比较其次生代谢途径和根际土壤环境因子，并采用多维统计方法探讨二者之间的内在关系。结果：结果表明，栽培白术通过调节DNA甲基化（DNA methylation）模式适应环境变化，表现出丰富的表观遗传多样性。此外，苯丙烷类（phenylpropanoids）、异黄酮类（isoflavonoids）和黄酮类（flavonoids）次生代谢途径存在显著差异。土壤氮营养和pH值被确定为关键环境驱动力，高效氮转化和弱酸性条件更有利于白术栽培。根际真菌（rhizosphere fungi）是关键微生物调控者，通过能量途径（β-氧化（b-oxidation）、糖酵解（glycolysis）、乙醛酸循环（glyoxylate cycle））、辅因子产生（泛醌（ubiquinone）、血红素（heme））以及氨基酸和脂质代谢（营养供应、释放磷脂酸（phosphatidic acid）和活性氧（ROS））影响次生代谢。讨论：相比之下，细菌主要通过释放毒力因子支持土壤铁营养、污染物降解和病原体感染性调节。总之，白术次生代谢过程受“土壤环境-根际微生物群（soil environment-rhizosphere microbiota）”系统协同调控。这些发现为白术规范化栽培和资源开发提供了理论基础。

研究背景与问题：白术（Atractylodes macrocephala）为菊科（Compositae）苍术属（Atractylodes）多年生药用植物，以干燥根茎入药。现代药理研究认为，倍半萜内酯（如白术内酯Atr I、II、III）和多糖为其主要活性成分。由于野生资源过度采挖和生境破坏，商品市场主要由栽培白术供应。现有研究多集中于种质资源、药用特性、不同产地或野生与栽培群体主成分差异，以及基于遗传多样性和群体遗传结构的生存潜力与抗风险能力评价；有关栽培白术根际土壤环境因子与次生代谢途径之间互作机制的研究仍较少。根际土壤既是植物养分获取的关键界面，也是药材质量形成的重要驱动力；土壤微生物、酶活和理化性质可影响活性成分积累，而次生代谢产物又可通过根系分泌物影响根际微生态。因此，研究人员在不同品质等级白术中开展表观遗传、次生代谢与根际土壤环境的关联研究，以识别影响次生代谢途径的关键因素。研究人员选取湖南省岳阳市平江县药用植物种植基地的4个品质等级白术，即不同栽培年限的1年（B1）、2年（B2）、3年（B3）和4年（B4），系统比较其次生代谢途径和根际土壤环境，并通过多维统计解析内在关系。研究结果表明，栽培白术可通过调节DNA甲基化模式适应环境变化，并保持丰富的表观遗传多样性；苯丙烷类、异黄酮类和黄酮类次生代谢途径差异显著；土壤氮营养和pH值为关键环境驱动力，高效氮转化和弱酸性条件更有利于白术栽培；根际真菌为核心微生物调控者，细菌则主要在铁营养、污染物降解和病原感染性调节中发挥辅助作用；白术次生代谢受“土壤环境-根际微生物”系统协同调控。该研究为白术标准化栽培和资源开发提供了理论依据。

主要关键技术方法：样本来自湖南省岳阳市平江县药用植物种植基地；2023年11月采集B1、B2、B3、B4四个品质等级白术根茎，每年限随机6株；2023年5月采集不同栽培年限小区叶片，每小区随机15株。关键技术包括超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）检测代谢物，外标法定量Atr I、II、III和多糖；甲基化敏感扩增片段多态性（MSAP）分析CG甲基化；根际土壤理化性质与酶活性测定；16S rRNA和ITS扩增子测序；PICRUSt2功能预测；偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、线性判别分析效应量（LEfSe）、主成分分析（PCA）、Mantel检验、Spearman相关分析和冗余分析（RDA）。

研究结果：

不同品质白术差异次生代谢比较分析：研究人员采用UHPLC-MS分析4个品质等级白术次生代谢物，鉴定2326个化学组分，确认1152个结构，其中黄酮类最丰富（25%），萜类次之（17.88%）。质量控制与保证显示，相对标准偏差（RSD）<30%的特征比例约为65%，数据稳定。Atr I和II含量在样品间差异显著，而白术多糖无差异；B2的Atr-II最高，B3的Atr-I最高。层次聚类和PCA显示B3与B4相似，B1形成独立分支；PLS-DA结果与PCA一致，Q²=0.992。差异代谢物分析显示B1下调代谢物最多。基于超几何检验、介数中心性拓扑分析和KEGG数据库检索，得到7条显著差异代谢途径，研究聚焦其中6条核心途径，主要涉及苯丙烷生物合成至白术特异性次生代谢物合成。JA波动最显著，植物激素信号经ABC转运蛋白途径传递，调控苯丙烷生物合成及其黄酮/异黄酮分支，代谢产物又通过根系分泌物反馈调节根际微生物。B2次生代谢较稳定，Atr-II最高，被认为更具药材开发潜力。

不同品质白术表观遗传分化与多样性分析：研究人员采用MSAP标记分析表观遗传变异，发现白术总体甲基化水平较高，总甲基化率超过50%，全甲基化水平超过25%，B3可达29%。表观遗传分化系数Gst为0.2038，约80%变异存在于不同品质等级群体内。PCoA显示B1与B4明显分离，B2与B3重叠区域减少。物种水平多态位点百分率（PPL）超过95%，期望杂合度（He）超过0.30，Shannon多样性指数（I）超过0.49，表明表观遗传多样性高。研究认为，DNA甲基化模式调整是白术响应外部环境刺激并发生表观遗传分化的主要驱动因素。

不同品质白术根际土壤理化性质、酶活性与微生物组成差异分析：根际土壤理化性质在4个品质等级间差异显著。B1的土壤有机碳（SOC）和NH₄⁺-N最高，B2的SOC显著较低，B3的土壤含水量（SMC）和总氮（TN）最高，B4的NO₃^--N和pH最高。酶活性方面，B4除碱性磷酸酶（ALP）外三种酶活性最高，B1的ALP活性最高。细菌16S rRNA分析显示，B1至B4前20个优势属相对丰度呈下降趋势，α多样性逐渐增加；β多样性显示B3与B4聚类，B1单独成簇；LEfSe发现B1特有细菌类群；PICRUSt2功能预测显示B1上调代谢途径最多，B4下调最多。真菌ITS分析显示，B1真菌α多样性显著较低，B2、B3、B4间无显著差异；β多样性显示B3与B4较相似；LEfSe显示B1具有独特优势真菌群；功能预测显示B1真菌上调途径最多，B2最少。总体上，B3与B4根际微生物结构更相似，且真菌群落差异比细菌更显著，可能对白术次生代谢途径调控更关键。

土壤环境因子与次生代谢途径的Mantel检验与Spearman相关分析：研究人员以6条显著差异代谢途径及其前10个贡献代谢物为对象，进行Spearman相关分析。结果显示，次生代谢因子（Formononetin、Xanthosine、Phloretin、Aesculetin、Rotenone）与信号转导代谢因子（Jasmonic acid、L-histidine、Guanosine）呈显著“镜像”分布；土壤pH、NO₃^--N、TN以及土壤蔗糖酶（S-SC）、土壤脲酶（S-UE）与次生代谢因子显著正相关，与信号转导代谢因子显著负相关；微生物群落多样性表现一致趋势。细菌半乳糖代谢和真菌1,3-丙二醇生物合成与次生代谢因子负相关，与信号转导代谢因子正相关。Mantel检验表明，土壤理化因子和酶活性，尤其S-UE、NH₄⁺-N、NO₃^--N、TN和pH，对6条代谢途径影响极显著；微生物群落结构和功能亦影响显著，且真菌群落相关性比细菌更显著。RDA进一步确认上述结果。研究认为，土壤氮源信号、pH以及微生物群落结构与功能是引起白术次生代谢途径分化的关键驱动因子。

讨论部分总结：在次生代谢差异响应机制方面，研究人员认为白术不同栽培年限的次生代谢途径和主要次生代谢物差异，主要由植物激素信号和运输途径调控，激活苯丙烷、黄酮和异黄酮生物合成途径，并对下游次生代谢物产生级联影响。根际土壤环境可诱导以JA为主的激素信号响应，经ABC转运途径介导，激活主要防御代谢途径，并间接调节倍半萜等代谢；部分次生代谢物经根系分泌物返回根际，重塑微生物群落和土壤养分，形成反馈循环。在表观遗传变异方面，不同品质等级白术维持高表观遗传多样性，说明表观结构稳定、无明显瓶颈效应，种子保存繁殖可有效保存优良性状；表观遗传分化明显，DNA甲基化差异突出，表观调控可快速响应生境胁迫。在土壤理化性质与酶活性协同调控方面，土壤氮营养和pH是关键因素。碳氮平衡假说认为，氮充足时植物优先生长而抑制防御次生代谢，氮不足时通过诱导防御积累次生代谢物；NH₄⁺-N与防御次生代谢途径负相关。TN与脲酶活性正相关，S-UE分解尿素产生NH₄⁺-N，再经硝化生成NO₃^--N，NH₄⁺-N积累又反馈抑制S-UE。较高土壤氮有效性可抑制JA等防御激素，间接促进生长素合成与转运，抑制苯丙烷途径而激活黄酮/异黄酮途径，其产物通过反馈抑制生长素过量积累并清除ROS。所有样品pH均高于5.0，表明当前栽培可抑制土壤酸化；酸性环境可能抑制主要次生代谢物合成，同时通过铝离子等金属胁迫诱导防御信号。在真菌影响机制方面，根际真菌群落结构和功能对白术次生代谢途径具有决定性影响，多样性作用尤其显著。真菌通过能量代谢（β-氧化、糖酵解、乙醛酸循环）、辅因子（泛醌、血红素）以及氨基酸和脂质代谢（营养供应、释放磷脂酸和ROS）重塑根际碳氮循环，刺激植物激素信号转导。其作用表现为“资源竞争”和“防御诱导”：高强度真菌能量代谢与次生代谢间接负相关，因竞争脂肪酸和葡萄糖等底物；真菌氨基酸代谢补充土壤营养，使植物优先生长而非防御，与信号转导途径负相关；真菌辅因子合成与信号转导正相关，反映感染潜力增强；真菌脂质代谢产生磷脂酸和ROS等毒力因子，增强诱导防御反应，间接促进次生代谢物合成。在细菌影响机制方面，细菌群落多样性虽影响白术次生代谢途径，但总体作用弱于真菌，更多因子与主要差异代谢途径无显著相关。细菌主要通过“环境改善”和“生物胁迫”发挥作用：通过铁载体分泌改善土壤铁营养，缓解缺铁胁迫，减少防御激素产生与转运；其氨基酸代谢和污染降解功能优化根际营养环境并降低毒性，使植物更多资源用于生长，故与防御信号/转导及次生代谢负相关；细菌感染性和毒力因子释放则作为外源刺激，迅速激活植物免疫，诱导JA信号，增强防御代谢，故与相关代谢途径正相关。土壤微生物多样性较高通常表示养分循环顺畅和养分可用性充足，白术更多资源用于生长，并需产生黄酮等代谢物抑制生长素积累，因此与防御机制呈负相关。

研究结论翻译：本研究表明，白术可通过调节DNA甲基化模式适应不同土壤环境，同时维持高表观遗传多样性。土壤氮营养和pH值是最关键的环境驱动因子，通过碳氮平衡和激素信号（如JA）与代谢途径最强关联。高效氮转化和弱酸性环境条件更有利于次生代谢物积累。根际真菌作为核心微生物驱动者，通过“资源竞争”和“防御诱导”调控白术次生代谢途径，而细菌主要在“环境改善”和“生物胁迫”中发挥辅助作用。总体而言，白术次生代谢物的合成与积累受“土壤环境-根际微生物群”多维网络协同调控。尽管如此，本研究仍存在局限。未来研究应对土壤环境因子调控白术代谢途径进行更全面的分析和验证，并探索表观遗传层面的微观调控机制。