Akkermansia muciniphila作为类风湿关节炎发病相关候选肠道共生菌：高IgA包被、HLA-DR递呈肽及T/B细胞反应研究

《Frontiers in Immunology》：Identification of Akkermansia muciniphila as a candidate gut commensal involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

　　

目的：“黏膜起源假说”（mucosal origins hypothesis）认为，黏膜部位（如肠道）是免疫反应最初发生的部位，这些免疫反应可能在数月到数年后导致临床类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）。研究人员的目标是开展一项基于发现、产生假说的研究，使用相对少量患者的样本，以提示既往未被识别的高IgA包被共生菌群可能在RA发病机制中发挥作用（主要结局）。次要支持性结局为确定是否可在滑膜组织中鉴定出来自此类菌群的HLA-DR递呈微生物肽，并确定针对这些肽及瓜氨酸化（citrullination）蛋白的T细胞和B细胞反应。方法：通过16S rRNA测序鉴定RA患者粪便样本中高IgA包被的细菌分类群；通过液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC–MS/MS）从滑膜组织中鉴定来自最常见、高IgA包被微生物的HLA-DR递呈肽；通过IFNγ酶联免疫斑点（enzyme-linked immunospot, ELISpot）试验确定针对所鉴定微生物表位和人模拟表位的T细胞反应，并通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定针对相关微生物蛋白和人蛋白的瓜氨酸化IgG和IgA抗体。结果：32例RA患者中，28例（88%）粪便样本中具有高IgA包被的Akkermansia muciniphila（Am）。从RA滑膜组织中鉴定出HLA-DR递呈的来自两种Am蛋白的肽，包括分子伴侣DnaK蛋白（molecular chaperone DnaK protein, Am-cDnaK），提示该微生物或其组分可能到达关节。21例患者中8例（38%）对Am-cDnaK肽和人热休克蛋白模拟肽（human heat shock protein-mimic peptide, Hu-HSPA5）具有T细胞反应和/或对这些蛋白的瓜氨酸化形式具有IgG抗体。反应性主要见于临床RA转化后不久的pre-RA和早期RA，在关节炎后期发作中较少见。结论：这些数据提示Am是参与RA发病机制的候选肠道共生菌，并可能为规划更大规模研究提供指南，以检验如下假说：Am以及某些其他高IgA包被共生菌群或其组分有时可能到达关节，在那里通过表位模拟（epitope mimicry）和表位扩展（epitope spreading）启动或增强自身免疫性T细胞反应，导致关节中针对瓜氨酸化宿主蛋白的抗体反应。

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种慢性炎症性多关节炎，由遗传和环境因素推动。特定HLA-DR分子经共用表位（shared epitope, SE）向Th1细胞递呈抗原，以及抗瓜氨酸化蛋白抗体（anti-citrullinated protein antibodies, ACPA）形成，是疾病关键标志。越来越多证据支持“黏膜起源假说”（mucosal origins hypothesis），即肠道、牙周或肺等黏膜部位是这些免疫反应最初发生之处，常早于临床RA数年。既往吸烟、牙周炎相关微生物及肠道共生菌曾被提出可能触发此类免疫反应。根据该假说，初始步骤是对细菌蛋白（包括瓜氨酸化细菌蛋白）的黏膜免疫反应；因表位模拟（epitope mimicry）和表位扩展（epitope spreading），反应扩展至瓜氨酸化自身蛋白。抗体为何靶向关节尚不清楚。一种假设是黏膜免疫反应包含针对瓜氨酸化微生物和人蛋白的交叉反应抗体，可靶向关节自身蛋白；修正假说认为某些共生菌或其组分可到达关节，点燃失调的促炎免疫反应。2013年，Scher et al.报道新发RA（new-onset RA, NORA）粪便中Prevotella spp.，尤其P. copri过度扩增。研究人员既往用nano-LC–MS/MS从1例RA患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）鉴定HLA-DR递呈的P. copri 27-kD分泌蛋白（Pc-p27）肽，并从滑膜鉴定与Prevotella硫酸酯酶同源的瓜氨酸化自身蛋白N-acetylglucosamine-6-sulfatase（GNS）肽；42%和32%患者分别有T/B细胞反应，3/18 RA患者滑液中检测到Prevotella DNA。多中心Etiology of Rheumatoid Arthritis队列血清提示P. copri在临床前RA演变中可能具有病因作用。其他研究者证明携带疾病相关转座子的P. copri菌株在两种小鼠关节炎模型中增强关节炎症。近期，Subdoligranulum didolesgii（S. dido）被鉴定为RA潜在致病共生菌；用来自RA风险个体IgA和IgG双阳性浆母细胞的单克隆抗体在粪便中鉴定，一个分离株可激活RA患者CD4⁺ T细胞，单定植小鼠出现RA样关节炎。因此，P. copri和S. dido提示可能有多个肠道微生物促进RA进展。研究人员报告第三种肠道共生菌Akkermansia muciniphila（Am）作为候选，开展一项基于发现、产生假说的回顾性病例对照研究，主要结局为提示既往未识别的高IgA包被共生菌群在RA发病中的作用，次要支持结局为鉴定滑膜中HLA-DR递呈微生物肽及T/B细胞对相关肽和瓜氨酸化蛋白的反应。

研究人员的关键技术方法包括：从RA患者粪便以IgA-SEQ分选IgA阳性与阴性细菌，并行16S rRNA测序计算IgA包被指数（IgA coating index, ICI）；对滑膜组织、滑液单核细胞（synovial fluid mononuclear cells, SFMC）或PBMC行免疫亲和纯化，以nano-LC–MS/MS鉴定HLA-DR递呈肽，并用TepiTool、IEDB和BLAST预测表位及人模拟肽；用IFNγ ELISpot检测PBMC T细胞反应；用ELISA检测对天然和瓜氨酸化重组Am-cDnaK、Ruminococcus torques DnaK（Rt-cDnaK）、人HSPA5的IgG/IgA；并行体外瓜氨酸化及Mann–Whitney U检验和Fisher精确检验。样本队列来源为Massachusetts General Hospital风湿科连续RA患者，部分滑膜/SFMC来自额外慢性RA患者，健康对照来自实验室人员及MGH血库去标识血清。

结果1，RA患者粪便中高IgA包被微生物群的鉴定（Identification of highly IgA-coated microbiota in stool samples from RA patients）：32例RA患者中16例NORA、16例慢性RA（chronic RA, CRA）。IgA-SEQ和16S rRNA测序显示多种高IgA包被菌（ICI ≥ 0.7）。Am在28/32例（88%）中高IgA包被，中位ICI为1.00（可检测范围0.74–1.00），16/32例达最大ICI；Rt在30/32例（94%）中高IgA包被，中位ICI为1.00（范围0.14–1.00），25/32例达最大ICI。NORA与CRA结果相似，故合并展示。

结果2，从滑膜组织、SFMC或PBMC中鉴定HLA-DR递呈微生物肽（Identification of HLA-DR-presented microbial peptides from synovial tissue, SFMC, or PBMC of RA patients）：用nano-LC–MS/MS分析既往4例及近期2例RA患者样本。从RA5滑膜组织鉴定Am钠/钙协同转运蛋白（Am sodium/calcium symporter, Am-SCS）肽LPQAFAKMGSSVVFGS；从RA3滑膜组织和RA4 SFMC鉴定Am-cDnaK肽RIINEPTAAALAYG。Rt数据库亦分配至相同核心序列。TepiTool预测额外表位，共鉴定或预测11个微生物肽。BLAST发现8个Am-自身模拟肽对和3个Rt-自身模拟肽对。Am-cDnaK与人HSPA5、HSPA9及热休克同源71-kDa蛋白具有相同9氨基酸预测HLA-DR结合核心；最接近的Am-cDnaK与Hu-HSPA5仅P-2和P10侧翼不同。这些肽预测强结合RA SE等HLA-DR分子。

结果3，对微生物和人模拟肽的T细胞反应性（T cell reactivity to microbial and human mimic peptides）：21例有PBMC。18例粪便Am IgA⁺。3/18例对滑膜鉴定Am-SCS A1肽有阳性T细胞反应，1例另对预测Am-SCS肽反应；5/18例对Am-cDnaK A6肽反应，3例对其他Am-cDnaK肽，2–4例对相应人模拟H6–H8肽反应。20/21例粪便Rt IgA⁺，其中4/20例对Rt-HSP70 R1肽反应，常对R2–R3及人模拟H6、H8、H9肽反应。4/18例（22%）Am IgA⁺患者对Am-SCS和Am-cDnaK一致阳性，常伴Rt-HSP70和人模拟肽反应，提示T细胞表位模拟和表位扩展。粪便Am IgA阴性3例及健康对照无反应。

结果4，对瓜氨酸化Am、Rt和人模拟蛋白的IgA和IgG抗体反应（IgA and IgG antibody responses to citrullinated Am, Rt, and human mimic proteins）：ELISA显示4/21例（19%）RA患者对瓜氨酸化Am-cDnaK有阳性IgG反应，其中3例对瓜氨酸化蛋白反应高于天然蛋白；最高IgG反应者亦有IgA反应。骨关节炎、脊柱关节病及健康对照可见对天然Am-cDnaK的IgG或IgA反应，但对瓜氨酸化蛋白反应较低。对瓜氨酸化Rt-cDnaK或Hu-HSPA5的反应见于另1例RA和2例健康对照，但不高于天然蛋白。纵向11例中5例至少一个时间点对瓜氨酸化Am-cDnaK阳性；4例发生在pre-RA或临床RA转化后不久，1例发生在发病后数年两次关节炎发作；2例对瓜氨酸化Hu-HSPA5低水平反应。

结果5，T和B细胞数据总结（Summary of T and B cell data）：21例中2例对Am-SCS、Am-cDnaK及Hu-HSPA5/Hu-HSPA9模拟肽有T细胞反应，并有抗瓜氨酸化Am-cDnaK的IgG，其中1例亦有抗瓜氨酸化Hu-HSPA5；2例仅有T细胞反应而无抗体；4例仅有抗瓜氨酸化Am-cDnaK的IgG，2例另有弱抗瓜氨酸化Hu-HSPA5。总计8/21例（38%）对Am-cDnaK肽和人模拟肽Hu-HSPA5有T细胞反应和/或对瓜氨酸化形式有IgG抗体。

结果6，根据对Am-cDnaK的系统免疫反应比较临床发现（Comparison of clinical findings according to systemic immune responses to Am-cDnaK）：8例有反应者与13例无反应者相比，中位年龄、性别比、SE频率及粪便高IgA包被Am频率相近。有反应组呈新发RA比例更高趋势（62.5% vs 38.5%，P=0.38）、ACPA和类风湿因子（rheumatoid factor, RF）阳性更高趋势（50% vs 15.4%，P=0.15）、C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）中位值更高趋势（12.2 vs 3.4，P=0.2），疾病活动评分（Disease Activity Score, DAS）略高；均无统计学显著差异。

结果7，敏感性分析（Sensitivity analysis）：pre-RA 1例、早期RA 10例中5例、慢性RA 10例中2例对Am-cDnaK肽和人模拟肽Hu-HSPA5有T细胞反应和/或对瓜氨酸化形式有IgG。提示系统性免疫反应可能发生在pre-RA向临床RA转变前后，但Hu-HSPA5反应人数不足以确定分子模拟首次出现时间。

讨论部分总结：多数RA患者粪便中有多种高IgA包被菌；因PBMC和血清有限，研究人员选择Am和Rt进一步研究。88%有高IgA包被Am，94%有高IgA包被Rt。IgA是黏膜表面主要抗体同种型，高IgA结合标记潜在致病菌。Am和Rt均定植黏膜屏障并降解肠道黏蛋白；Am还产生黏蛋白，作用可能依情况利弊。黏蛋白降解破坏肠黏膜屏障，使菌结合黏膜，引起炎症并可能血行播散。Am和Rt与炎症性肠病、结直肠癌等相关；Am在多发性硬化中增加，患者自身反应CD4⁺ T克隆可与HLA-DR递呈Am肽及髓鞘人模拟肽交叉反应，脑脊液中抗Am IgG升高；Am减少与肥胖、2型糖尿病、高血压相关。微生物系统播散至关节并非黏膜起源假说必需，但可在遗传或环境风险者中致病。RA滑膜中曾检测到细菌肽聚糖。本研究用nano-LC–MS/MS鉴定Am-SCS和Am-cDnaK，认为其为Am来源，理由包括100%同源、患者对其他预测Am表位反应、Am肽刺激T细胞及抗瓜氨酸化Am蛋白抗体。8/21例（38%）对Am-cDnaK和人模拟肽Hu-HSPA5有T细胞反应和/或IgG，与既往Pc-p27的32%一致。细菌与人热休克蛋白间T细胞表位模拟既往与RA相关；Van Herwijnen et al.在鼠模型中鉴定结核分枝杆菌DnaK表位和人模拟表位mB29a，可刺激RA、银屑病关节炎或健康对照PBMC T细胞增殖和促炎细胞因子；耐受性树突状细胞试验正在探索。ACPA见于约60%–80% RA患者，其他病少见；牙周病原Porphyromonas gingivalis或Aggregatibacter actinomycetemcomitans及EBV等曾被报道与ACPA产生相关。本研究中骨关节炎、脊柱关节病及健康对照可有天然Am-cDnaK或Hu-HSPA5抗体，但仅RA患者对瓜氨酸化形式反应；未发现明确抗瓜氨酸化Rt-DnaK反应。Am-cDnaK与Rt-cDnaK T细胞表位几乎相同，但蛋白仅59%同源，可能解释抗体交叉反应差异。讨论提出：Am高IgA包被，可结合肠黏膜、血行播散并被单核/巨噬细胞吞噬；通常不致疾病，但在遗传易感者中可诱导ACPA和RF；偶尔Am或其组分到达关节，在RA风险者向活动性疾病转变时，最高Am免疫反应可能增强或点燃关节炎症。需确定促炎与抗炎平衡、细胞因子谱、T效应/Treg比例及瓜氨酸化抗体糖基化。表位模拟和扩展可进一步发展为针对纤维蛋白原、α-烯醇化酶、波形蛋白和组蛋白等瓜氨酸化人蛋白的自身免疫。DMARD治疗减轻炎症，部分或完全恢复对Am耐受，但已确诊RA者可复发。局限包括样本量小、仅研究Am和Rt及两个Am蛋白、其他Am外表面蛋白可能更具抗原性、其他高IgA菌未探索、关节关联基于HLA-DR递呈而无关节液PCR、仅检测HLA-DRB1而某些DQ也相关、无正常对照菌群比较、健康对照未匹配、亚组比较多为趋势、Hu-HSPA5反应人数少。尽管如此，该研究为假设生成性研究。

研究结论翻译：这些数据提示Am是参与RA发病机制的候选肠道共生菌，并可能为规划更大规模研究提供指南，以检验如下假说：Am以及某些其他高IgA包被共生菌群或其组分有时可能到达关节，在那里通过表位模拟和表位扩展启动或增强自身免疫性T细胞反应，导致关节中针对瓜氨酸化宿主蛋白的抗体反应。该初步研究提示Am作为候选肠道共生微生物可能在RA发病机制中发挥作用，并为探索共生微生物如何启动或增强自身免疫性关节炎症提供额外假说。