《Frontiers in Endocrinology》：Integrative transcriptomics and metabolomics reveal Cry1-associated hepatic alterations and plasma essential fatty acids as biomarkers of residual circadian disruption post-sepsis
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背景： 脓毒症会扰乱昼夜节律，即使在急性期恢复后，仍会留下持久的分子痕迹，并导致机体对时差反应出现昼夜节律不敏感。然而，脓毒症后残余昼夜节律功能障碍的核心机制及生物标志物仍不明确，这阻碍了针对性干预措施的开发。
方法： 研究人员对雄性小鼠进行非致
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背景： 脓毒症会扰乱昼夜节律，即使在急性期恢复后，仍会留下持久的分子痕迹，并导致机体对时差反应出现昼夜节律不敏感。然而，脓毒症后残余昼夜节律功能障碍的核心机制及生物标志物仍不明确，这阻碍了针对性干预措施的开发。
方法： 研究人员对雄性小鼠进行非致死剂量脂多糖（LPS）注射，恢复7天后，整合分析肝脏转录组学与血浆代谢组学数据。开展行为学、生理学及分子水平分析，统计学检验包括DESeq2、Student's t检验、MetaCycle及受试者工作特征（ROC）曲线分析。
结果： 观察到显著的转录组改变，其中以昼夜时间21（ZT21）最为突出。亚油酸（LA）和α-亚麻酸（ALA）被鉴定为与脓毒症后昼夜节律紊乱相关的、不依赖采样时间的候选生物标志物。外源性补充这两种脂肪酸可缩短雄性小鼠的昼夜节律再同步周期。
结论： 本研究基于多组学关联，提出一个假设性的Cry1-必需脂肪酸轴可能参与脓毒症后昼夜节律功能障碍，为脓毒症幸存者昼夜节律紊乱的检测与治疗提供了新型生物标志物及代谢干预策略。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
脓毒症是由感染引起宿主反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，全球每年新发病例约4900万，死亡约1100万，占全球死亡总数的约20%。尽管急性期救治水平显著提高，但脓毒症幸存者常遗留长期认知障碍、睡眠紊乱和持续疲劳等慢性后遗症。流行病学数据显示，6.4%的脓毒症幸存者在出院后一年内新发睡眠障碍，且睡眠-昼夜节律紊乱与5年全因死亡率升高独立相关。在ICU住院患者中，超过60%存在昼夜节律错位和睡眠结构破坏，这些节律异常与谵妄、机械通气时间延长及康复延迟密切相关。
既往研究多聚焦于急性期细胞因子风暴、器官损伤及生命支持治疗，而对脓毒症恢复后的慢性病理生理改变、分子机制及干预靶点探索不足。尽管急性期炎症消退、器官功能恢复后，幸存者的生物钟同步能力仍持续受损，其机制并非简单的残余炎症效应，而是涉及长期代谢重编程和分子节律重塑的复杂过程。肝脏作为典型的周围生物钟器官，对脓毒症期间的全身炎症应激高度敏感，即使在急性炎症介质消退后，肝组织仍可保留既往炎症损伤的长期分子记忆，驱动持续的转录组和代谢组重编程。因此，肝脏是探测脓毒症后残余昼夜节律损伤并桥接核心时钟转录失调与循环血浆代谢物改变的理想组织。
多不饱和脂肪酸（PUFA）作为细胞膜结构成分和信号分子，在节律调控、炎症调节及神经功能维持中发挥关键作用。亚油酸（LA，ω-6）和α-亚麻酸（ALA，ω-3）是人体不能自身合成、必须依赖膳食摄入的必需多不饱和脂肪酸。最新研究证实，多不饱和脂肪酸是重要的非光合昼夜节律同步信号，可通过调控PER2蛋白磷酸化和核心时钟基因转录节律影响生物钟的相位和同步效率，ω-3/ω-6比例失衡可直接导致节律紊乱和时差适应能力下降。然而，脓毒症恢复后昼夜节律同步能力减弱的代谢机制尚不清楚，缺乏实验证据确定必需脂肪酸缺乏是否为核心驱动因素，更缺乏改善脓毒症幸存者长期节律紊乱的有效治疗方法。基于上述研究空白，研究人员提出假设：非致死性LPS暴露诱导肝脏核心时钟基因Cry1持续失调，部分重塑肝脏节律性转录组景观，并与血浆亚油酸和α-亚麻酸持续降低存在统计学关联，这些脂肪酸改变最终损害昼夜节律再同步能力。
二、主要技术方法
研究人员采用8周龄C57BL/6雄性小鼠（购自西安交通大学实验动物中心），通过非致死剂量LPS（5 mg/kg）腹腔注射构建脓毒症生存小鼠模型。整合肝脏转录组测序（RNA-Seq）与血浆非靶向代谢组学（液相色谱-质谱联用，LC-MS）分析，运用DESeq2进行差异表达基因（DEGs）鉴定，MetaCycle的JTK_Cycle算法和dryR模型进行节律性分析，Student's t检验结合FDR校正鉴定差异代谢物，OPLS-DA评估样本分组分离，ROC曲线评价候选生物标志物诊断效能，MEME Suite和HOMER进行转录因子基序富集分析。通过转轮活动记录评估昼夜节律再同步能力，qPCR验证基因表达，并构建Cry1/Cry2双敲除（DKO）小鼠进行遗传学验证。
三、研究结果
3.1 非致死剂量LPS注射后第7天小鼠行为学和生理学改变
LPS注射后7天，小鼠肝脏重量比、脾脏重量比、褪黑素水平、肝功能指标、血浆TNFα和IL-6水平均恢复至正常水平，代谢相关指标和食物摄入量两组间无显著差异。然而，LPS组小鼠血浆糖皮质激素水平在所有时间点均显著低于正常对照组（NC），可能反映急性期后皮质类固醇耗竭。行为学检测显示，LPS组小鼠在相位提前6小时后所需的再同步时间显著延长，表明存在持续的昼夜节律同步功能障碍。
3.2 肝脏全转录组学分析
跨六个昼夜时间点的转录组PCA分析显示LPS与NC样本间存在重叠，但OPLS-DA清晰分离两组。差异基因富集分析显示，LPS组上调基因主要富集于中性粒细胞胞外陷阱形成、细胞周期、细胞器分裂和核分裂等炎症相关及细胞增殖相关通路；下调基因主要富集于补体和凝血级联、血红素生物合成过程，反映LPS刺激后小鼠存在持续慢性炎症伴代偿性肝细胞增殖和功能抑制。qPCR验证了Ager、Src、Gsdmd和Pik3r5等免疫相关基因，ROC曲线确认两组间存在显著差异。
3.3 肝脏昼夜节律转录组学分析
JTK_Cycle分析显示，NC组鉴定出4417个节律基因，LPS组仅1919个，两组重叠1053个。dryR五模型分类揭示：Model 2（仅对照组有节律）富集于白细胞细胞间粘附正向调控、T细胞活化调控等免疫相关通路，提示LPS后基线振荡模式完全消融；Model 3（仅LPS组有节律）富集于有丝分裂DNA复制、核DNA复制和DNA复制起始通路，表明LPS刺激后激活再生相关通路；Model 5（两组均有节律但振幅或相位改变）富集于胆固醇生物合成和氨基酸代谢通路。LPS显著重塑了小鼠肝脏转录组水平的节律性变化，节律基因数量显著减少，昼夜节律基因稳态被破坏。
3.4 肝脏核心时钟基因表达模式
核心时钟基因整体节律性基本保持，但在特定时间点出现显著转录差异。Bmal1、Clock、Per1和Cry1在ZT21表现出显著差异，Per1和Nr1d1的峰值相位发生明显改变。qPCR独立样本验证了这些基因表达水平和峰值相位的变化，ROC曲线确认Bmal1、Clock、Cry1和Per1在ZT21对两组具有强区分能力。ZT21高表达基因热图显示LPS组节律性显著丧失，提示ZT21基因表达变化，特别是Bmal1、Clock、Cry1和Per1等核心基因，可能是急性昼夜节律紊乱的敏感指标。
3.5 核心时钟基因改变的可逆性
LPS注射后第0、3、5、7、9、11天ZT21时间点动态监测显示，Clock、Per1、Nr1d2和Dbp的表达在第7或第9天达到峰值后恢复正常水平，而Bmal1、Cry1、Cry2和Nr1d1在11天观察期内未恢复正常。这表明Bmal1、Cry1、Cry2和Nr1d1可能是LPS恢复小鼠急性昼夜节律失调的敏感指标，反映持续的分子损伤。
3.6 ZT21肝脏转录组学分析
LPS后第7天ZT21共鉴定出689个DEGs。基序分析显示，在众多核心时钟基因中，Cry1是最显著的上游核心调控因子。DEGs与Cry1相关性分析鉴定出34个强相关基因（|R|>0.5），主要涉及细胞周期（Ccne2、Cdc6、Asap2、Wee1）、昼夜节律（Per3、Noct）、能量代谢（Sco2、Clpx、Pdk4）及结构发育（Mafb、Odf3b、Col5a3）。qPCR验证了Clpx、Mafb、Asap2和Tymp的表达。在Cry1/Cry2双敲除小鼠中，LPS处理未能驱动这些靶基因产生稳健的表达变化，双因素方差分析显示Asap2存在显著的基因型-处理交互作用（p=0.016），Clpx呈类似趋势（p=0.066），而Mafb和Tymp无显著交互作用。DKO遗传实验仅对Cry1作为ZT21 DEGs上游调控因子的预测提供了部分实验支持。
3.7 雌性小鼠行为、生理和基因表达变化
LPS注射后7天，雌性小鼠行为活动和代谢指标与NC组无显著差异，但肝脏qPCR分析显示ZT21的Bmal1、Per1和Cry1显著下调，与雄性小鼠结果一致。这表明雌性小鼠虽表现出更好的行为适应能力，但同样存在不完整的分子恢复，核心时钟基因的分子损伤机制不受性别影响。
3.8 血浆代谢组学分析
血浆代谢组OPLS-DA清晰分离NC与LPS组。全时间点分析中，LysoPC(0:0/18:1(9Z))、Vinylamycin和LysoPC(20:3(8Z,11Z,14Z)/0:0)在LPS组显著上调，LysoPC(17:0/0:0)、2-Methoxy-6-prenylhydroquinone和Thiazolidine-4-carboxylic acid显著下调。KEGG通路分析显示差异代谢物主要富集于亚油酸代谢、酒精依赖和糠醛降解等通路。值得注意的是，亚油酸代谢通路中的亚油酸和α-亚麻酸在LPS组一致降低，相关代谢物Crepenynic acid、alpha-Dimorphecolic acid和Stearidonic acid也持续降低。代谢组节律分析显示NC组709个节律代谢物，LPS组835个，重叠391个。ZT1差异代谢物数量最多，且与ZT21转录组在通路层面一致性更强，提示代谢物产生滞后于转录组变化。ZT1差异代谢物中脂质分子占比最大，亚油酸代谢仍是最显著富集通路，亚油酸和α-亚麻酸仍是最显著改变的代谢物。
3.9 转录组-代谢组整合分析
整合分析发现不饱和脂肪酸生物合成通路显著富集，涉及Acnat2和Acot3基因以及亚油酸和α-亚麻酸代谢物。相关性分析显示亚油酸和α-亚麻酸与Acnat2、Acot3存在强相关，ROC曲线确认单独使用亚油酸或α-亚麻酸即可有效区分两组。ZT21差异基因Acnat2、Acot3、Acot4等与亚油酸和α-亚麻酸显著相关，且这两种脂肪酸与Cry1呈负相关。由于亚油酸和α-亚麻酸在LPS注射后7天多个时间点持续降低，研究人员提出血浆亚油酸和α-亚麻酸代表不依赖采样时间的候选生物标志物。外源性补充LA和ALA（1:1比例）显著缩短了小鼠的再同步周期，支持这些脂肪酸在促进昼夜节律适应中的潜在作用。
四、讨论与结论
本研究表明，尽管LPS注射后7天急性炎症、肝功能、炎症因子和褪黑素水平恢复正常，但小鼠节律再同步时间显著延长，证实持续性昼夜节律功能障碍与急性器官损伤无关。血浆糖皮质激素持续降低可能反映急性期耗竭并导致持续时钟失同步。代谢参数和食物摄入量组间相当，证实脓毒症后昼夜节律紊乱并非由整体代谢衰竭引起，而是特定分子节律重塑和靶向代谢重编程的结果。
转录组分析揭示脓毒症深刻重塑肝脏昼夜节律稳态，LPS组节律基因总数显著减少，伴持续低度炎症、代偿性肝细胞增殖和补体/凝血通路抑制。dryR五模型分类区分了脓毒症触发昼夜节律转录重塑的三种功能后果模式：免疫节律消融、再生通路时钟劫持和部分代谢节律重连。核心时钟基因保持整体节律性但出现显著时间特异性失调，以ZT21最为突出。Bmal1、Cry1、Cry2和Nr1d1至少持续异常表达11天，是持续性昼夜节律损伤的敏感指标。基序富集分析预测Cry1为ZT21转录组改变的首要上游调控因子，DKO遗传实验仅提供部分支持，提示非Cry1依赖通路也可能参与驱动脓毒症后肝脏转录组重塑。
性别差异研究发现，雌性小鼠在行为层面表现出更好的时差适应能力，但分子层面核心时钟基因表达与雄性相似，表明昼夜节律紊乱的分子机制不受性别影响，但缺乏严格的性别-处理交互统计分析，临床转化需进一步验证。
血浆LA和ALA被鉴定为脓毒症后昼夜节律失调的生物标志物，ROC曲线确认单独或联合使用均具有强诊断效能。与节律性转录本或时间依赖性激素不同，LA和ALA反映稳定的代谢特征，可在任何时间点可靠测量，极大便利临床转化。外源性补充LA和ALA显著缩短再同步周期，提供直接功能证据表明这些代谢物不仅是生物标志物，更是脓毒症后昼夜节律紊乱的有效治疗药物。整合分析显示LA和ALA与脂肪酸代谢关键酶Acnat2和Acot3密切相关，与Cry1负相关，提示潜在机制：失调的Cry1可能参与改变肝脏脂肪酸基因表达和随后的LA/ALA降低，最终损害昼夜节律同步。但DKO实验未验证普遍的Cry1依赖调控，该Cry1-必需脂肪酸轴仍是基于相关性的假设，需进一步分子和遗传学验证。
研究人员也指出，血浆TNF-α和IL-6虽恢复至基线水平，但肝脏转录组仍显示炎症通路富集，提示残余组织低度炎症可能影响LA/ALA作为昼夜节律生物标志物的特异性。此外，非致死性LPS诱导的内毒素血症模型缺乏活病原体驱动的感染特征，未来需开发改进的感染模型验证研究结论的普适性。
综上所述，本研究通过多组学分析系统探索了脓毒症恢复后雄性小鼠昼夜节律调节的残余特征，发现ZT21是检测昼夜节律紊乱的关键时间窗口，Cry1可能是参与该过程的核心调控基因。LA和ALA可作为脓毒症后昼夜节律紊乱的敏感生物标志物，外源性补充可有效改善脓毒症幸存者的节律同步能力。多组学分析为脓毒症后昼夜节律损伤中推测的Cry1-必需脂肪酸轴提供了相关性证据，并确定血浆LA和ALA为有前景的不依赖采样时间的生物标志物。外源性LA+ALA补充挽救了脓毒症恢复小鼠的昼夜节律再同步缺陷。未来需进一步解析Cry1依赖与非依赖通路对这些代谢和昼夜节律表型的因果贡献，探索LA、ALA与Cry1调控脓毒症后昼夜节律的具体分子机制，并在脓毒症幸存者中验证这些发现的临床应用价值，以改善脓毒症患者的长期康复。
