甲基化谱揭示小肠神经内分泌肿瘤中 chr18 丢失相关的表观遗传程序

《Frontiers in Oncology》：Methylation profiling reveals epigenetic programs associated with chr18 loss in small intestinal neuroendocrine tumors

　　

引言：小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine tumors, SI-NETs）以低突变负荷和有限的复发性驱动突变为特征，提示其他机制参与肿瘤发生。SI-NETs 中最常见的基因组改变之一是18号染色体杂合性缺失（loss of heterozygosity on chromosome 18, chr18del），其定义了一个主要分子亚型。然而，该事件的表观遗传后果仍知之甚少。方法：在本研究中，研究人员使用长读长全基因组测序（long-read whole-genome sequencing）表征十二个原发肿瘤的全基因组DNA甲基化（DNA methylation）模式。天然甲基化检测（native methylation detection）和拷贝数谱分析（copy-number profiling）使肿瘤能够根据18号染色体状态进行分层，并直接比较 chr18del 与非 chr18del（二倍体）肿瘤之间的表观遗传状态。结果：相对于二倍体肿瘤，chr18del 肿瘤表现出广泛的低甲基化（hypomethylation），而18号染色体显示出空间结构化的区域甲基化差异，包括局部甲基化升高的区域。使用独立 Illumina EPIC 甲基化队列（Illumina EPIC methylation cohort）进行的跨平台验证（cross-platform validation）证实了许多甲基化事件的方向和分布。与相应转录组数据集（transcriptomic dataset）整合后显示，一部分甲基化变化与差异基因表达（differential gene expression）相关，符合已建立的启动子（promoter）和基因体（gene-body）甲基化模型。这些甲基化状态的功能分类（functional categorization）揭示了与神经元信号传导（neuronal signaling）、细胞内信号级联（intracellular signaling cascades）和细胞外基质（extracellular matrix）相互作用相关的调控模式。讨论：总之，这些发现支持18号染色体状态与广泛甲基化差异之间的关联，这些差异超出受影响的染色体，并与与神经内分泌肿瘤生物学相关的转录程序相关。

研究背景方面，小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine tumors, SI-NETs）是一种临床意义显著的肿瘤类别，生物学特征异质，可从缓慢生长到出现转移性病变。尽管诊断影像和系统治疗取得进展，精准治疗应用仍受限，延迟诊断常见，导致临床结局不佳。基于阵列平台和短读长测序的基因组研究显示，SI-NETs 相对于其他实体瘤具有低突变负荷，复发性编码驱动突变少见；SMAD 相关信号通路等基因突变已有报道，但唯一持续复发的突变位于 CDKN1B，仅约8%病例。这提示复发点突变之外机制可能更重要，尤其异常 DNA 甲基化等表观遗传失调。跨队列最常见事件是18号染色体杂合性缺失（chr18del），约50–70%肿瘤存在。chr18del 可作为初始孤立基因组改变；无该事件肿瘤常见染色体增益、缺失和基因组不稳定。临床上 chr18del 肿瘤与更有利结局相关，进展无生存改善，与侵袭性较低一致。染色体18状态是 SI-NETs 主要分子分层轴。然而连接18号染色体丢失与特定肿瘤亚型的分子通路尚未完全阐明，观察到的分子模式差异不能仅由染色体缺失解释，提示染色体丢失、表观遗传控制和基因表达之间存在多层面相互作用。由于 chr18del 是较大染色体改变而非局部突变，其分子关联可能超出18号染色体基因并涉及更广泛全基因组调控差异。长读长全基因组 DNA 甲基化测序可同时评估 DNA 甲基化和拷贝数变异（copy-number variation, CNV），允许直接比较 chr18del 与二倍体肿瘤并识别与染色体18状态相关的表观遗传模式。

研究人员开展的研究是：对十二个原发 SI-NET 肿瘤及配对正常样本进行长读长全基因组测序，结合天然甲基化检测与拷贝数谱分析，按染色体18状态分层，比较 chr18del 与二倍体肿瘤的表观遗传状态；并用独立 EPIC 甲基化队列和转录组、单细胞转录组数据验证。结论支持染色体18状态与广泛甲基化差异相关，这些差异延伸到受影响染色体之外，并与神经内分泌肿瘤生物学相关转录程序相联系。其意义在于将 chr18del 从拷贝数事件扩展为与区域结构化甲基化及转录状态相关的分子分层依据。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员对12个冷冻原发回肠 SI-NET 肿瘤及配对正常样本（生物样本库；正常来自非肿瘤肠或肝组织或外周血，作为胚系参考，不纳入差异甲基化分析）进行 Nanopore 长读长全基因组测序，直接检测 5mC 甲基化，并用 QDNAseq 推断拷贝数，将肿瘤分为 chr18del 与二倍体；用 Modkit 检测 CpG 甲基化，DSS 鉴定差异甲基化位点（differentially methylated loci, DML）和差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs）。独立验证使用 Patte et al. 的147例原发 SI-NET Illumina Infinium Methylation EPIC 阵列队列，以自适应窗口整合。转录组分析使用 Patte et al. 队列及 Alvarez et al. 的44例 RNA-seq，Salmon 定量、RNAseqCNV 和 GATK 推断 chr18 状态；单细胞 RNA-seq 来自三个独立 SI-NET 研究，Seurat 处理和 pseudobulk 验证，limma 校正批次。

全基因组和区域差异甲基化：Nanopore 长读长全基因组测序在十二个原发 SI-NET 肿瘤和配对正常样本中进行，拷贝数谱将肿瘤分为 chr18del 与二倍体，原生 5mC 甲基化直接检测，实现全基因组 CpG 分析而不需亚硫酸氢盐转化；肿瘤平均覆盖度28.5X（SD 5.1X），中位 read N50 18.0 kb（IQR 15.9–22.2 kb）。全基因组检测约4.2百万 DML，其中约3.0百万（71.3%）在二倍体肿瘤高甲基化，约1.2百万（28.7%）在 chr18del 肿瘤；平均甲基化差异分别为 +0.166 和 -0.168，提示两组间全基因组甲基化变化方向相反但总体平衡。区域水平检测82,796个 DMR，其中55,542（67.1%）在二倍体肿瘤高甲基化，27,254（32.9%）在 chr18del 肿瘤；区域甲基化差异 +0.216 和 -0.224，大于单位点效应，符合聚集 CpG 位点协调甲基化移动。

chr18del 相关甲基化变化的染色体分布：跨平台比较显示方向模式一致，平均 Δβ 主要为负，表明 chr18del 肿瘤相对二倍体肿瘤全局低甲基化。18号染色体显示显著空间结构化区域甲基化差异，包括 chr18del 肿瘤甲基化升高区域；但染色体平均水平支持有限，Nanopore 显示18号染色体平均甲基化差异为正，而 EPIC 估计接近零。全基因组区域甲基化差异跨平台方向一致率为88.4%。9、19、22等染色体在 chr18del 肿瘤中明显低甲基化。敏感性分析显示 chr18del 肿瘤18号染色体测序覆盖降低，中位覆盖13X vs 27X（p=0.013），相对覆盖中位0.62 vs 1.04（p=0.0057）；但染色体范围加权甲基化相似，中位0.730 vs 0.734（p=0.745），且在10X至25X最小覆盖阈值下甲基化估计稳定。

使用 EPIC 阵列的差异甲基化跨平台验证：独立147例原发 SI-NET EPIC 阵列队列经质控后保留79.8%探针；差异甲基化分析鉴定276,905个显著探针（FDR<0.05），其中48,587个（17.5%）Δβ≥0.10。EPIC 探针被聚合为自适应基因组窗口，得到18,613个一致性窗口，其中857个满足一致性和效应量标准为强窗口。82,796个 Nanopore DMR 中18,664个（22.5%）与至少一个一致性 EPIC 窗口重叠，超过随机预期（empirical p<0.001）。方向一致率88.4%（exact binomial test p<2×10^-16；95% CI 0.879–0.888）。回归分析显示 Nanopore 与 EPIC 甲基化差异显著相关（β=0.18，R²=0.08，p<2×10^-16；Pearson r=0.283）。Nanopore 检测幅度更大，EPIC 动态范围更压缩，但基因组分布模式一致。

基因体和启动子差异甲基化：EPIC 支持的 DMR 被注释并分层为基因体和启动子区间。与全基因组分析一致，chr18del 肿瘤总体低甲基化，而18号染色体显示局部高甲基化。唯一映射到基因体的 EPIC 支持 DMR 有3402个，其中706个在 chr18del 肿瘤高甲基化，2696个在二倍体肿瘤高甲基化，提示二倍体相关基因体高甲基化占优。启动子相关区域类似，1079个 EPIC 支持启动子 DMR 中，143个在 chr18del 肿瘤高甲基化，936个在二倍体肿瘤高甲基化。跨平台验证的甲基化差异发生在基因体和启动子，且主要由二倍体肿瘤甲基化增加驱动。

chr18del 相关转录变化的跨队列研究：Patte et al. EPIC 甲基化队列包含多数样本基因表达数据，可整合启动子和基因体甲基化与转录输出，并与独立 Alvarez et al. 数据集比较。Patte 队列 n=147，chr18del 占42.8%，由短读长全基因组测序定义；Alvarez 队列 n=44，chr18del 占43.2%，由 RNA-seq 推断。差异表达分析（FDR<0.05）在 Patte 中鉴定4916个显著基因，在 Alvarez 中鉴定425个；共享349个（Patte 的7.0%，Alvarez 的82.1%），Alvarez 独有76个，Patte 独有4567个。重叠基因方向一致率高：47.3%在 chr18del 肿瘤中一致下调，52.1%一致上调，仅2个重叠基因方向不一致。支持一部分染色体18状态相关表达差异跨队列一致。

chr18del 肿瘤中方向性甲基化-表达关系：Patte 队列匹配甲基化和表达数据用于检验甲基化差异与转录变化是否符合已建立表观遗传模型。应用效应量阈值：显著差异表达（FDR<0.05）、绝对 log₂ fold change≥0.5、甲基化差异≥0.15。在此过滤集中，232个基因体高甲基化事件与表达增加相关，138个基因体低甲基化事件与表达降低相关。启动子高甲基化主要与表达降低相关，涉及53个基因；仅1个基因显示启动子低甲基化伴表达增加。结果符合启动子甲基化通常抑制转录、基因体甲基化可与活跃转录状态相关的模型。

功能性甲基化状态分类：基于启动子和基因体甲基化关系，基因被分为三种功能甲基化状态。启动子高甲基化伴或不伴基因体低甲基化者为 Repressed，符合启动子相关转录沉默；无启动子甲基化的基因体高甲基化者为 Stable，反映与有效转录延伸相关模式；无启动子甲基化的基因体低甲基化者为 Unstable，符合转录稳定性降低。应用该框架鉴定87个 Stable 基因在 chr18del 肿瘤中上调，54个 Unstable 基因和44个 Repressed 基因表达降低。

甲基化定义基因集的功能通路富集：为探索与甲基化定义转录状态相关的生物过程，185个定义三种功能状态的基因用于功能富集。Gene Ontology（GO）富集分析排除位于18号染色体基因。Stable 状态基因富集神经元和突触组分；Unstable 状态基因富集细胞信号、通讯和膜相关过程；Repressed 状态富集细胞外区域和细胞外空间注释，并由 MPST 和 TST 驱动硫转移酶和氰酸盐相关条目，后者应谨慎解释。十个甲基化定义基因位于18号染色体，均归类为 Unstable；由于缺失染色体上基因表达降低可能反映直接基因剂量效应，这些基因被排除 GO 富集和表观遗传解释。功能富集因此反映18号染色体之外基因。

甲基化定义候选基因的跨队列验证：为评估甲基化定义基因集的跨队列可重复性，在 Alvarez et al. 表达数据集中评估其表达。保留30个基因：Stable 状态25个（28.7%），Unstable 状态4个（7.4%），Repressed 状态1个（2.2%），表明 Stable 转录程序跨队列可重复性最高。跨队列 Stable 候选基因中，ADAMTS9、ADAMTS9-AS2、CASR 和 SYT13 特别受关注，在 chr18del 肿瘤中表达增加且甲基化模式符合 Stable 状态。

使用单细胞转录组数据集的肿瘤细胞验证：为评估30个甲基化定义候选基因是否由 SI-NET 肿瘤细胞表达而非主要反映 bulk 组织中非肿瘤细胞群体，在三个独立 SI-NET 单细胞 RNA-seq 数据集中检查其表达。除 CIBAR1-DT 外，所有基因均在三个数据集的 SI-NET 肿瘤细胞中检测到，支持候选基因集的肿瘤细胞表达。

讨论部分总结：研究人员使用长读长全基因组测序表征 SI-NETs DNA 甲基化景观，结合原生甲基化检测和同时拷贝数分析，按染色体18状态分类肿瘤。chr18del 肿瘤相比二倍体肿瘤显示全基因组低甲基化 DMR 占优，差异在区域上异质而非整条染色体均匀分布。其他拷贝数架构是 SI-NETs 异质性潜在来源，本研究长读长队列中若干肿瘤存在额外 CNV，包括4、5、7、10、14、20号染色体复发性增益；但样本量限制无法按多 CNV 状态进行有意义上统计分层，因此保留染色体18状态为主要分组变量，未确定其他拷贝数改变对甲基化模式的独立贡献。与 Patte et al. 独立数据集整合提供跨平台支持，约22.5% Nanopore DMR 与 EPIC 窗口重叠并方向一致，主要反映区域水平一致而非染色体范围平均甲基化等同。与 Patte 表达数据集整合及 Alvarez 验证显示一部分区域甲基化差异与 chr18del 和二倍体肿瘤差异表达相关。根据启动子和基因体甲基化框架分类，启动子甲基化通常与转录抑制相关，基因体甲基化可与转录活跃状态相关。仅有限甲基化相关基因位于18号染色体；这些 cis 相关基因表达降低可能反映直接基因剂量效应，不能独立归因于基因甲基化。主要功能解释基于18号染色体之外的 trans 相关基因。功能富集提示甲基化定义基因状态与 SI-NET 生物学相关过程有关，包括神经分泌功能、细胞内信号和细胞外基质相互作用，符合肠嗜铬细胞依赖特化分泌机制及微环境相互作用的功能特征。候选基因包括 ADAMTS9 及其反义转录本 ADAMTS9-AS2，二者被报道为表观遗传调控肿瘤抑制因子；CASR 在胃肠胰神经内分泌肿瘤中被报道受表观遗传调控；SYT13 是囊泡运输调节因子，其表达与肠嗜铬来源肿瘤细胞神经分泌机制改变一致。三个独立单细胞 SI-NET 数据集支持这些候选基因的肿瘤细胞表达。Unstable 和 Repressed 状态复制有限，需在更多 SI-NET 表达数据集中评估。Patte 和 Alvarez 数据集间存在显著定量表达差异，可能反映队列大小、测序设计、文库深度和染色体18状态推断差异；Alvarez 队列更小，使用单端非链特异性 RNA 测序，而 Patte 使用双端链特异性测序，且 Patte 中 Salmon 定量显示更高中位文库深度。限制包括 Nanopore 队列较小；甲基化调用未按单倍型解析，不能排除等位基因特异性甲基化对18号染色体局部甲基化差异的贡献；相对宽松的固定修饰概率阈值0.7用于增加信号捕获，可能保留较多低置信度修饰调用；更大长读长队列将需要建立染色体18状态相关甲基化模式普遍性、阐明机制并评估额外 CNAs 是否改变这些关联。最后，目前分析主要通过甲基化变化与转录组输出关联来评估甲基化变化，因此可能遗漏未反映在转录组中的调控机制。未来需要整合染色质可及性及其他调控层数据的研究，以进一步表征与18号染色体状态相关表观遗传差异的机制。