黄芪甲苷IV通过Treg相关调控CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应及PI3K/AKT信号改变减轻缺血后神经炎症

《Frontiers in Immunology》：Astragaloside IV attenuates post-ischemic neuroinflammation associated with Treg-related regulation of CD86/CD206-associated brain myeloid phenotypic responses and PI3K/AKT signaling alterations

　　

背景： 缺血性脑卒中（ischemic stroke）触发持续性神经炎症（neuroinflammation）、小胶质细胞（microglia）活化及外周免疫改变，从而加重继发性脑损伤。黄芪甲苷IV（Astragaloside IV，AS-IV）是黄芪（Astragalus membranaceus）的主要生物活性成分，具有神经保护及免疫调节作用，但其对调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）及CD86/CD206相关小胶质细胞表型反应的影响尚不清楚。 目的： 本研究探讨AS-IV是否通过Treg相关免疫反应、PI3K/AKT信号改变及CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应减轻缺血后神经炎症。 材料与方法： 采用线栓法建立小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。AS-IV治疗后评估神经功能缺损、梗死体积及组织病理学损伤。采用蛋白质印迹法（western blotting）及酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）评估缺血脑组织中炎症细胞因子及PI3K/AKT相关信号。转录组学分析（transcriptomic analysis）鉴定AS-IV相关的生物学过程及信号通路。流式细胞术（flow cytometry）定量CD4+CD25+FOXP3+调节性细胞群，并进一步分析脾脏及颈淋巴结中CD4+FOXP3+细胞群，以及脑组织CD11b+CD45low/int细胞群内CD86+/CD206+表型反应。免疫荧光（immunofluorescence）评估脑CD3+FOXP3+信号及Iba1/CD86或Iba1/CD206双阳性信号。采用抗CD25干预评估Treg相关免疫反应在AS-IV相关效应中的参与程度。 结果： AS-IV减少MCAO后梗死体积，神经功能缺损评分呈改善趋势，并减轻组织病理学损伤。AS-IV降低缺血脑组织中IL-6和TNF-α水平，升高IL-10和TGF-β水平。转录组学分析鉴定出与PI3K/AKT信号通路及免疫调节过程相关的改变，蛋白质印迹法显示AS-IV治疗后p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT比值升高。AS-IV增加脾脏及颈淋巴结中Treg比例，并增强脑组织中CD3+FOXP3+信号。AS-IV同时减少CD86+相关脑髓系细胞表型反应，增加CD206+相关脑髓系细胞表型反应。抗CD25部分减弱AS-IV相关的神经功能及脑损伤改善作用，以及其对炎症细胞因子和脑髓系细胞表型反应的影响。 结论： AS-IV通过Treg相关免疫反应及PI3K/AKT相关信号改变减轻缺血后神经炎症，并伴随CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应的变化。上述发现支持AS-IV作为缺血性脑卒中潜在神经免疫调节干预手段。

一、研究背景与科学问题

缺血性脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一，构成重大的公共卫生负担。其核心病理事件为脑动脉的急性闭塞。尽管静脉溶栓和血管内取栓术已改善部分患者的预后，且血管内治疗的适应证和治疗时间窗不断拓展，但临床获益仍受限于时间依赖性筛选、患者选择以及再灌注后的继发性损伤。脑缺血及再灌注可触发氧化应激、血脑屏障破坏、免疫细胞浸润和持续性神经炎症，从而放大神经元损伤并限制神经功能恢复。因此，抑制缺血后炎症、重塑神经免疫微环境并减轻神经元损伤的策略在缺血性脑卒中研究中具有重要地位。

神经炎症密切参与缺血性脑损伤的演变过程。脑缺血后，小胶质细胞作为中枢神经系统的主要常驻免疫细胞，感知局部组织损伤并呈现多种功能状态。CD86阳性小胶质细胞通常与促炎反应及IL-6、TNF-α等炎症细胞因子的产生相关；相反，CD206阳性小胶质细胞更常与炎症消退、组织修复及免疫调节活性相关。越来越多的证据也关注脑内常驻免疫与外周免疫反应之间的交互作用。调节性T细胞（Tregs），尤其是FOXP3阳性Tregs，已被认为参与神经免疫稳态的维持。既往研究表明，脑相关Tregs可能通过限制胶质细胞过度活化、调节细胞因子释放及支持修复过程来抑制过度适应性免疫活性并影响损伤后炎症环境。因此，Treg相关免疫调节可能连接外周免疫反应与脑内小胶质细胞表型反应。然而，药物干预能否调节这一调控环节从而减轻缺血性脑卒中后的神经炎症，此前尚不清楚。

黄芪甲苷IV（AS-IV）是黄芪中主要的生物活性成分之一，属于环阿屯烷型三萜皂苷。黄芪作为传统中药，长期以来被用于脑卒中相关疾病的经典方剂中。AS-IV具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及免疫调节作用。实验研究表明AS-IV可保护脑缺血损伤，并通过作用于炎症反应、氧化应激和细胞损伤改善缺血后病理变化。然而，其免疫机制尚未完全阐明，特别是AS-IV相关Treg反应与缺血后神经炎症调节之间的关系仍知之甚少。PI3K/AKT信号通路参与细胞存活、炎症调节和免疫稳态维持。在缺血性脑损伤中，PI3K/AKT相关信号与神经保护、炎症调节和细胞表型反应相关。但AS-IV相关PI3K/AKT信号改变如何与Treg相关免疫反应及CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应相关联，仍不完全清楚。

基于上述背景，本研究采用小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，评估AS-IV对缺血性脑卒中后神经功能缺损、脑梗死体积、组织病理学损伤及炎症反应的影响，并通过转录组学分析、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定、流式细胞术和免疫荧光染色，系统探讨PI3K/AKT相关信号、Treg相关免疫反应及CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应。研究进一步引入抗CD25干预，以验证Treg相关免疫调节是否参与AS-IV的作用。该研究的核心创新在于将Treg相关免疫反应置于AS-IV治疗后缺血性脑卒中相关外周–中枢免疫变化的整体框架中，而非单独重复验证AS-IV的抗炎、PI3K/AKT相关或CD86/CD206相关效应。

二、主要关键技术方法

研究人员采用雄性C57BL/6J小鼠（SPF级，22–25 g，购自河南斯克贝斯生物科技有限公司），通过线栓法建立MCAO模型，缺血1.5小时后拔出线栓实现再灌注。AS-IV以20 mg/kg剂量腹腔注射，每日一次，连续7天；阳性对照药丁苯酞（NBP）以90 mg/kg灌胃给药。抗CD25抗体（克隆PC61）于MCAO前2天腹腔注射（250 μg/只）以减弱Treg相关免疫反应。研究采用Zealonga神经功能缺损评分和改良神经功能严重程度评分（mNSS）评估神经功能；TTC染色检测脑梗死体积；HE染色和尼氏染色评估组织病理学损伤和神经元存活；RNA测序（RNA-seq）结合GO/KEGG富集分析和基因集富集分析（GSEA）探讨转录组变化；蛋白质印迹法检测炎症细胞因子及PI3K/AKT磷酸化水平；ELISA定量脑组织细胞因子浓度；流式细胞术检测脾脏、颈淋巴结Treg比例及脑组织CD11b⁺CD45^low/int细胞群中CD86⁺/CD206⁺细胞比例；免疫荧光染色评估脑CD3⁺FOXP3⁺信号及Iba1/CD86、Iba1/CD206双阳性信号。

三、研究结果

3.1 AS-IV减轻MCAO后缺血性脑损伤

研究人员通过TTC染色发现，MCAO组出现明显的白色梗死区域，而AS-IV治疗显著缩小梗死面积。神经功能缺损评分在MCAO后显著升高，AS-IV治疗显示评分降低趋势，但经Dunn多重比较校正后未达统计学显著性（校正P=0.0854）。HE染色显示MCAO组出现组织疏松、细胞间隙增大、空泡样改变和核固缩，AS-IV治疗减轻了这些病理变化。尼氏染色显示MCAO组尼氏阳性神经元减少，AS-IV治疗保留了更多尼氏阳性神经元。上述结果表明AS-IV减少了脑梗死损伤、显示出改善神经功能缺损的趋势并减轻了组织病理学损伤。

3.2 AS-IV改善MCAO后神经炎症微环境

蛋白质印迹法和ELISA检测显示，MCAO组IL-6和TNF-α水平较假手术组升高，AS-IV治疗降低了两者水平；IL-10和TGF-β在AS-IV治疗后表达升高。ELISA结果与蛋白质印迹法结果一致：AS-IV降低IL-6和TNF-α水平，升高IL-10和TGF-β水平。NBP干预也显示出改善炎症细胞因子表达的趋势。上述结果表明AS-IV通过降低促炎细胞因子水平和增强免疫调节细胞因子表达改善了神经炎症微环境。

3.3 转录组学分析揭示AS-IV治疗后全局基因表达变化及免疫相关功能改变

RNA-seq分析显示，MCAO与假手术组比较共鉴定出147个差异表达基因（DEGs），其中129个上调、18个下调；AS-IV与MCAO组比较共鉴定出214个DEGs，其中52个上调、162个下调。两组DEGs取交集并要求调控方向相反，获得37个共同反向调控基因。KEGG富集分析将PI3K–Akt信号通路列为MCAO组下调基因和AS-IV组上调基因的高排名候选通路，但经Benjamini–Hochberg校正后未持续保持统计学显著性。GO富集分析显示MCAO后多种免疫和炎症相关生物学过程富集，AS-IV组下调基因富集于T细胞分化调节和白细胞介素-1受体活性等免疫相关条目。GSEA分析中，PI3K–Akt信号通路在MCAO与假手术组比较中显示名义富集（NES=1.35，名义P=0.012），但FDR校正后不显著（FDR=0.150）。转录组学分析鉴定出广泛的免疫相关转录改变，并将PI3K/AKT作为候选信号轴，但未单独确立AS-IV对PI3K/AKT通路的协同激活。

3.4 AS-IV调节MCAO后PI3K/AKT相关信号

蛋白质印迹法检测显示，与假手术组相比，MCAO组p-PI3K/PI3K比值降低，AS-IV治疗升高了该比值；p-AKT/AKT比值呈现相同模式。上述结果表明MCAO后PI3K/AKT相关磷酸化降低，AS-IV治疗后升高，提供了PI3K/AKT相关信号改变的独立蛋白质水平证据。

3.5 AS-IV增强MCAO后Treg相关免疫反应

流式细胞术检测显示，脾脏中Treg比例在MCAO组较假手术组轻度升高，AS-IV治疗后进一步升高。抗CD25干预显著降低脾脏Treg比例，抗CD25+AS-IV组显示部分恢复趋势。颈淋巴结结果与脾脏结果总体一致：AS-IV组Treg比例高于MCAO组，抗CD25干预降低Treg比例，抗CD25+AS-IV组较抗CD25组部分恢复但仍低于AS-IV组。CD4⁺FOXP3⁺细胞群的CD25非依赖性分析显示相似趋势。脑组织免疫荧光检测显示，AS-IV组CD3⁺FOXP3⁺细胞比例较MCAO组升高，抗CD25干预降低该比例，抗CD25+AS-IV组较抗CD25组部分恢复。上述结果表明AS-IV增加了外周Treg比例并增强了脑组织中CD3⁺FOXP3⁺信号。

3.6 抗CD25干预部分减弱AS-IV相关的神经功能缺损和缺血性脑损伤改善

在五组机制验证队列中，mNSS评分在MCAO组较假手术组显著升高，AS-IV治疗显著降低mNSS评分。抗CD25+AS-IV组较抗CD25组显著降低mNSS评分，较AS-IV组显示评分升高趋势但未达统计学显著性。TTC染色显示AS-IV显著减少梗死体积，抗CD25+AS-IV组梗死体积较AS-IV组显著增加，但较抗CD25组显著降低。HE染色显示MCAO组和抗CD25组缺血性组织病理学改变更明显，AS-IV组和抗CD25+AS-IV组有所减轻。尼氏染色显示AS-IV显著增加神经元保留，抗CD25+AS-IV组尼氏阳性神经元较AS-IV组显著减少，但较抗CD25组显著增加。上述结果表明抗CD25干预部分削弱了AS-IV相关的神经保护作用，而AS-IV在抗CD25干预下仍保留部分保护效应。

3.7 抗CD25部分减弱AS-IV对炎症细胞因子表达的调节作用

蛋白质印迹法和ELISA检测显示，AS-IV治疗降低IL-6和TNF-α表达、升高IL-10和TGF-β表达。抗CD25+AS-IV组IL-6和TNF-α水平高于AS-IV组但低于抗CD25组；IL-10和TGF-β水平在抗CD25干预后降低，抗CD25+AS-IV组较抗CD25组部分恢复。上述结果表明抗CD25干预部分减弱但未消除AS-IV相关的抗炎调节作用，提示Treg相关免疫反应可能参与AS-IV对MCAO后神经炎症微环境的调节。

3.8 AS-IV调节MCAO后CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应

流式细胞术检测显示，CD11b⁺CD45^low/int细胞群中CD86⁺细胞比例在MCAO组较假手术组升高，AS-IV治疗降低该比例；抗CD25干预后该比例升高，抗CD25+AS-IV组介于AS-IV组和抗CD25组之间。CD206⁺细胞比例在MCAO后升高，AS-IV治疗后进一步升高；抗CD25干预降低该比例，抗CD25+AS-IV组较抗CD25组部分恢复。免疫荧光染色支持流式细胞术结果：Iba1/CD86双阳性信号在MCAO后增强、AS-IV治疗后减弱、抗CD25干预后再次增强；Iba1/CD206双阳性信号在AS-IV组更强、抗CD25干预后减弱、抗CD25+AS-IV组部分恢复。上述结果表明AS-IV调节了MCAO后CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应，抗CD25干预减弱了这一效应，提示Treg相关免疫反应可能参与AS-IV对脑髓系细胞表型反应的调节。

四、讨论与结论

讨论部分指出，神经炎症在缺血性脑卒中继发性损伤和神经功能恢复受损中起重要作用。本研究证实AS-IV减少了脑梗死体积、显示出改善神经功能缺损评分的趋势并减轻了组织病理学损伤，同时将炎症细胞因子谱转向降低促炎细胞因子表达和升高免疫调节细胞因子表达。转录组学分析提示PI3K/AKT相关信号和免疫调节过程可能参与AS-IV的作用，后续实验证实AS-IV增加了脾脏和颈淋巴结中Treg比例并增强了脑组织中CD3⁺FOXP3⁺信号，同时调节了缺血脑中CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应。抗CD25干预降低了外周Treg比例和脑组织中CD3⁺FOXP3⁺信号，并部分减弱了AS-IV对神经功能和脑损伤结局、炎症细胞因子表达及脑髓系细胞表型反应的作用。

讨论部分强调，PI3K/AKT信号通路参与细胞存活、炎症调节、组织修复和小胶质细胞表型调节。本研究中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值在MCAO后降低、AS-IV治疗后升高，表明AS-IV干预后PI3K/AKT相关磷酸化增强。尽管PI3K–Akt通路富集在多重检验校正后未持续保持统计学显著性，但仍为转录组学分析中排名较高的候选通路，蛋白质印迹结果为PI3K/AKT相关信号改变提供了额外支持。研究同时指出，CD11b⁺CD45^low/int门控策略可能无法完全区分常驻小胶质细胞与浸润的单核细胞来源巨噬细胞，因此观察到的CD86/CD206相关变化更宜解释为脑髓系细胞表型反应而非严格的小胶质细胞特异性改变。

研究局限性包括：未使用PI3K/AKT通路抑制剂或细胞特异性干预；RNA-seq每组仅3个生物学重复；PI3K–Akt通路富集未持续保持校正后显著性；抗CD25的特异性有限，CD25也表达于活化常规T细胞；脑免疫荧光未提供与脑流式细胞术或CD3/CD4/FOXP3多标记分析相同的表型分辨率；AS-IV对Zealonga评分的影响未达统计学显著性；未常规进行脑血流监测确认动脉闭塞和再灌注成功；Treg相关免疫反应是否直接或间接调节脑髓系细胞表型反应仍需体外共培养、阻断实验和细胞特异性验证。

研究结论：AS-IV减少了脑梗死损伤、显示出改善神经功能缺损评分的趋势并减轻了MCAO后神经炎症。AS-IV的作用可能超越对单一炎症细胞因子的抑制，涉及多层次免疫炎症调节，包括PI3K/AKT相关信号、Treg相关免疫调节及CD86/CD206相关脑髓系细胞表型反应。上述发现为AS-IV作为缺血后神经炎症的潜在干预手段提供了实验证据，并为缺血性脑损伤中Treg相关调节脑髓系细胞表型反应的进一步研究提供了基础。