《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Decoding the lncRNA landscape in bovine mastitis: insights into immune regulation and gene networks underlying host response
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摘要专业翻译
背景 长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是基因表达的关键调控元件，在牛乳腺炎等疾病的免疫调控中发挥重要作用。本研究评估了由两种病原体——无乳链球菌（Streptococcus agalactiae；Sa+
摘要专业翻译
背景 长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是基因表达的关键调控元件，在牛乳腺炎等疾病的免疫调控中发挥重要作用。本研究评估了由两种病原体——无乳链球菌（Streptococcus agalactiae；Sa+）和原壁菌属（Prototheca spp.；P+）引起的亚临床乳腺内感染（subclinical intramammary infection，sIMI）中lncRNAs的表达谱，并预测了其在31头荷斯坦奶牛中与蛋白编码基因的相互作用。研究人员对lncRNAs的伙伴基因进行了数量性状位点（quantitative trait loci，QTL）注释和富集分析，以全面了解其与表型性状的潜在关联。最后，采用偏相关与信息理论（Partial Correlation and Information Theory，PCIT）和调控影响因子（Regulatory Impact Factor，RIF）算法评估差异表达lncRNAs（differentially expressed lncRNAs，DELs）与差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的共表达网络。
结果 在Sa+ vs. Neg、P+ vs. Neg、Sa+ vs. P+以及未感染与感染动物（Mast vs. Neg）的比较中，分别鉴定出211、146、353和184个DELs。这些DELs大多位于基因区域内，其中78%此前未在牛参考基因组中注释。总体而言，无乳链球菌感染同时调控免疫和代谢通路（脂质代谢、细胞外基质合成），而原壁菌属感染则激活免疫信号网络（B细胞和固有免疫）。Sa+诱导的特异性lncRNAs被预测靶向控制脂肪酸合成和乳脂QTLs的基因，而P+诱导的lncRNAs则主要与免疫基因和体细胞数QTLs相关。共表达网络还揭示了两类感染之间共享的lncRNAs，提示存在核心应答：两种感染汇聚于共同的核心基因（如EBF1、BTLA），表明可能存在保守的宿主防御机制。
结论 这些结果表明，尽管lncRNA表达模式存在差异，但下游调控通路——尤其是与免疫功能相关的通路——可能在亚临床乳腺内感染期间汇聚于共同的宿主应答。这些发现共同强调了lncRNA介导的牛乳腺调控的复杂性，并凸显了开展功能研究以阐明这些新型转录本生物学作用的必要性。
论文解读
研究背景与科学问题
乳腺炎，尤其是亚临床型乳腺炎，不仅是奶牛群面临的重大健康挑战，也造成了显著的经济负担。由于缺乏明显的临床症状，亚临床乳腺炎往往难以被及时发现，却会导致体细胞数持续升高、乳品质和产量下降以及淘汰率增加。除经济损失外，亚临床乳腺炎还通过引起慢性炎症和不适影响动物福利。此外，为控制乳腺炎而使用抗菌药物，特别是在病原体难以清除且病情反复或转为慢性时，已促进了抗菌药物耐药性的产生和发展。这些多方面的挑战凸显了深入理解发病机制背后分子通路的重要性。
在这一背景下，非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）对基因表达的调控在决定奶牛对乳腺炎的易感性或抵抗性中发挥着关键作用。长链非编码RNA（lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的转录本，构成功能高度多样的基因表达调控元件。曾被视为基因组"暗物质"的lncRNAs，现已被公认为通过转录和转录后机制（包括染色质修饰和可变剪接）对基因表达进行关键调控。值得注意的是，lncRNAs通过调控细胞分化、细胞周期以及JAK-STAT、MAPK和NF-κB等关键信号通路来影响炎症反应。
既往研究多采用体外实验，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和脂多糖等常见乳腺炎病原体刺激乳腺上皮细胞，但这些方法往往缺乏精确的病原体水平分辨率，限制了对特异性宿主应答的理解。为弥补这一不足，本研究纳入了详细的细菌学诊断，以确定乳腺炎的致病因子，包括无乳链球菌和原壁菌属——一种新兴的藻类病原体。原壁菌对常规抗生素治疗具有耐药性且难以检测，鉴于其新兴性和缺乏有效治疗方案，lncRNAs可能为理解宿主易感性或抵抗性机制提供新视角。研究人员通过整合转录组功能数据与病原体鉴定，旨在揭示lncRNA介导的调控网络，为改善奶牛乳腺炎抵抗力的替代诊断标记或遗传选择策略提供依据。
研究内容与结论概述
本研究以31头荷斯坦奶牛为对象，通过RNA测序（RNA-Seq）评估了自然发生的亚临床乳腺内感染（sIMI）期间牛乳腺中lncRNAs的表达谱，并预测了其与靶蛋白编码基因的潜在相互作用。研究定义了三个实验组：健康奶牛（n=9）、无乳链球菌自然感染动物（n=11）和原壁菌属自然感染动物（n=11）。通过整合转录组功能数据与病原体鉴定，研究揭示了不同病原体感染下lncRNA介导的调控网络及其与表型性状的潜在关联。
关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：样本来源于意大利威尼托地区一个商业化奶牛群的31头荷斯坦奶牛，经两次细菌学检查（间隔两周）确认感染状态后分为三组。RNA提取自牛奶体细胞，使用MGIEasy RNA Library Prep试剂盒构建文库并在DNBSEQ-G400平台进行双端测序。生物信息学分析流程包括：使用HISAT2将clean reads比对至牛参考基因组（ARS-UCD1.2），Cufflinks组装转录本，FEELnc流程鉴定lncRNAs（包括filter、codpot和classifier三个模块），DESeq2进行差异表达分析，GALLO包进行QTL注释和富集分析，CeTF包中的PCIT算法构建共表达网络，RIF算法评估调控影响因子，Cytoscape及cytoHubba插件进行网络可视化和核心节点鉴定。
研究结果
动物数据与测序比对：31头奶牛平均泌乳天数为235（±78）天，平均胎次2.5。测序后每样本平均获得1.19亿条reads，与牛基因组的平均比对率为91.92%，其中85.69%为唯一比对。
lncRNA鉴定：通过Cuffcompare组装获得2,463,167条转录本，经FEELnc筛选后鉴定出40,586条lncRNAs，其中13,840条（34%）为已注释，26,746条（66%）为新型lncRNAs。新型lncRNAs中位长度为2,587 bp，中位外显子数为2，中位GC含量为46.35%。基因组分布显示62.5%位于外显子区域，18%位于内含子，9.5%位于上游基因间区，9.5%位于下游基因间区。BTA3、BTA11和BTA13染色体包含最多lncRNAs。
lncRNAs差异表达分析：在Sa+ vs. Neg、P+ vs. Neg、Sa+ vs. P+和Mast vs. Neg四个比较组中分别鉴定出211、146、353和184个DELs。大多数DELs位于基因区域，其中基因重叠和基因嵌套亚型占比最大。约78%的DELs为新型lncRNAs。
QTL注释与富集分析：在Sa+ vs. Neg、P+ vs. Neg和Sa+ vs. P+比较中，分别鉴定出1,197、712和2,110个注释QTLs。大多数伙伴基因与乳品QTL类别共定位。Sa+感染中显著富集了与乳脂和脂肪酸组成、乳凝固特性相关的QTLs；P+感染中富集了体细胞数、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞数量相关QTLs；Sa+ vs. P+比较中富集了临床乳腺炎相关QTLs。
DELs与DEGs调控机制：PCIT分析构建了各比较组的共表达网络。在Sa+网络中，U6、SLC39A10、EBF1和CYSLTR1为高度连接节点；P+网络中BANK1、TNFRSF13B和EBF1为关键节点。cytoHubba分析确定了各比较组的前10个核心变量，包括ARHGAP24、BTLA、EHD3、CYSLTR1、EBF1等基因及新型lncRNA TCONS_00028733。RIF分析分别在Sa+ vs. Neg、P+ vs. Neg和Sa+ vs. P+比较中鉴定出22、13和34个排名前5%的lncRNAs。
讨论与结论
无乳链球菌与免疫-代谢通路调控：Sa+感染中最显著上调的新型lncRNA TCONS_00388494预测与XYLT1基因相互作用，该基因编码蛋白聚糖生物合成关键酶。另一个上调的lncRNA TCONS_00578761预测与ADGRE3基因互作，该基因在粒细胞中高表达并参与脂质合成。QTL富集分析显示Sa+感染中近半数lncRNA伙伴基因聚集于乳脂和脂肪酸组成相关QTL区域，与既往基因表达研究中观察到的脂肪酸代谢激活一致。共表达分析中TCONS_00326333与FOXK2、TCONS_00085341与CBR4呈现强正相关，两者均参与脂肪酸代谢调控。cytoHubba分析中CYSLTR1为最高排名基因，编码半胱氨酰白三烯受体，是强效脂质炎症介质。
原壁菌属与免疫应答调控：P+感染中TCONS_00638308和TCONS_00638309均预测与PDE10A基因互作，该基因参与环核苷酸稳态并涉及T淋巴细胞活化调控。P+感染中QTL富集主要与免疫应答性状相关，包括体细胞数和单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞数量。共表达网络中TCONS_00028733、TCONS_00579552和TCONS_00588162与多个B细胞信号基因（CD79B、FCRL3、BANK1、MS4A1、TNFRSF13B）及固有免疫基因（TLR10、CYSLTR1、BTLA、CD274、ITGA1）高度互作。TNFRSF13B被鉴定为最具信息量的变量之一，编码TACI受体，调控免疫细胞稳态和功能。
两类感染共享的调控机制：尽管无乳链球菌和原壁菌属在系统发育上相距甚远，但研究未观察到DELs靶基因或共表达调控机制的显著差异。在Sa+ vs. P+比较中，34个DELs中有9个在两种感染的共表达网络中共享，表明存在部分重叠的免疫调控应答。这些共享DELs与多个免疫和炎症相关基因及剪接体U2、U4、U5、U6基因互作。值得注意的是，EBF1、BTLA、SLC39A10和EHD3在两类感染中均为共享核心变量，提示核心免疫应答机制可能被保守激活。EBF1编码早期B细胞因子-1，在B细胞分化中发挥关键作用，并参与代谢和炎症信号通路的正向调控；BTLA编码B和T淋巴细胞衰减因子，作为免疫应答的抑制性检查点。
研究结论：本研究表明，尽管不同病原体诱导了不同的lncRNA表达模式，但下游调控通路——尤其是与免疫功能相关的通路——可能在亚临床乳腺内感染期间汇聚于共同的宿主应答。这些发现强调了lncRNA介导的牛乳腺调控的复杂性，并凸显了开展功能研究以阐明这些新型转录本生物学作用的必要性。研究同时指出了局限性：自然感染引入的生物学变异无法完全控制，基于乳区水平的感染状态分类与复合乳体细胞转录组分析之间可能存在稀释效应，以及牛奶体细胞组成在感染不同阶段可能变化。
